UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE AGRONOMÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS MENCIÓN: AGRICULTURA SOSTENIBLE ACUMULACIÓN DEL CADMIO EN PLANTONES DE Theobroma cacao (CACAO) OBTENIDOS MEDIANTE ENRAIZAMIENTO DE ESTAQUILLAS EN CONDICIONES DE VIVERO. Tesis Para optar el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS AGRÍCOLAS, MENCIÓN: AGRICULTURA SOSTENIBLE PRESENTADO POR: JORGE LUIS PAZ URRELO ASESOR: VICENTE SERAPIO POCOMUCHA POMA Tingo María – Perú. 2025 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE AGRONOMÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS MENCIÓN EN AGRICULTURA SOSTENIBLE ACUMULACIÓN DEL CADMIO EN PLANTONES DE Theobroma cacao (CACAO) OBTENIDOS MEDIANTE ENRAIZAMIENTO DE ESTAQUILLAS EN CONDICIONES DE VIVERO Autor : Jorge Luis Paz Urrelo. Asesor : Vicente Serapio Pocomucha Poma. Área de investigación : Ciencias Agrícolas. Línea de investigación : Propagación de plantas y sistemas de producción agrícola. Eje temático : Acumulación del cadmio en órganos de plantas de cacao propagadas por enraizamiento de estaquillas. Lugar de ejecución : Distrito de Juan Guerra, Provincia de San Martín. Duración : Junio 2022 – Agosto 2023 Financiamiento : S/. 15, 959.00 Tingo María – Perú. 2025 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN UNIDAD DE GESTIÓN DE LA INVESTIGACIÓN FORMATO PARA REGISTRAR EL PROYECTO DE TESIS PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO Universidad : Universidad Nacional Agraria de la Selva. Escuela de posgrado : EPG-UNAS Posgrado : Maestría en Ciencias Agrícolas. Mención : Agricultura Sostenible. Título de Tesis : Acumulación del cadmio en plantones de Theobroma cacao (cacao) obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas en condiciones de vivero. Objetivo General : Determinar la acumulación del cadmio (Cd) en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas en condiciones de vivero. Autor : Jorge Luis Paz Urrelo DNI : 43452379 Correo electrónico : jorge.paz@unas.edu.pe Asesor de Tesis : Dr. Vicente Serapio Pocomucha Poma. Área de Investigación : Ciencias agrícolas. Grupo de Investigación : Plantas agrícolas, medicinales, ornamentales y florísticos. Línea de investigación : Propagación de plantas y sistemas de producción agrícola. Lugar de Ejecución : Distrito de Juan Guerra, Provincia de San Martín. Fecha de inicio : Junio de 2022 Fecha de término : Agosto de 2023 Presupuesto : S/. 15, 959.00 Financiamiento : Propio ( X ) FIF ( ) Externo ( ) Según resolución N° 461-2023 R-UNAS y resolución N°295 2023 R-UNAS mailto:jorge.paz@unas.edu.pe DEDICATORIA A Dios con toda la gratitud, que estuvo siempre a mi lado a pesar de las dificultades. A mis queridos padres Esaú Paz y Enit Urrelo, ejemplos de sacrificio y bondad. A Emanuel Paz, mi motivación clave para seguir adelante a pesar de las adversidades, quien con su cariño y amor me impulsó a seguir con constancia. A Lucero Marinel Paz, por alegrar cada día de mi existencia con su cariño, ternura y sonrisa. A Matías Benjamín Paz, quien alegrará mis días por siempre. A Violeta por su apoyo constante. AGRADECIMIENTOS Al Programa Nacional de Investigación Café y Cacao de la Estación Experimental Agraria El Porvenir, San Martín del Instituto Nacional de Innovación Agraria – INIA. A Los docentes de la Universidad Nacional Agraria de la Selva – UNAS, en especial al Dr. Vicente Pocomucha Poma, por su aporte y asesoramiento en el desarrollo del presente trabajo de investigación. A Los Miembros del jurado Dr. José Wilfredo Zavala Solórzano, presidente por su aporte en la corrección académica científica en base a las normas de redacción de la Universidad, al Dr. Hugo Huamaní Yupanqui y al M.Sc. Jaime Chávez Matías, por sus aportes y revisión del presente trabajo de investigación. A Sergio Vega por el soporte estadístico y sus atinadas sugerencias para el análisis y redacción del presente trabajo de investigación. A Edith Vela por el soporte constante en la parte ofimática para redacción del presente trabajo de investigación. A Todas las personas que contribuyeron directa e indirectamente con el desarrollo del presente trabajo de investigación. ÍNDICE GENERAL Página RESUMEN ABSTRACT I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1 II. REVISIÓN DE LITERATURA .................................................................................. 4 2.1. Descripción morfológica del cacao. .................................................................. 4 2.1.1. Clasificación taxonómica del cacao ....................................................... 4 2.1.2. Propagación asexual del cultivo de cacao: Estaquillas. ......................... 5 2.2. Metales pesados: Cadmio (Cd). ......................................................................... 6 2.2.1. Fuentes de origen del Cd. ...................................................................... 6 2.2.2. Mecanismos de trasporte y efectos fitotóxicos del Cd. ......................... 7 2.3. Genotipos de cacao utilizados en el presente estudio. ....................................... 8 III. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 9 3.1. Ubicación del experimento. ............................................................................... 9 3.2. Equipos y materiales. ......................................................................................... 9 3.3. Tipo y nivel de investigación. ............................................................................ 10 3.3.1. Diseño de investigación. ........................................................................ 10 3.3.2. Población y muestra. .............................................................................. 12 3.4. Metodología ....................................................................................................... 12 3.4.1. Cuantificar la concentración de Cd en plantones de Thebroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. ................................. 12 3.4.2. Determinar el factor de translocación del Cd en plántulas de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. ... 36 3.4.3. Identificar plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas con menor capacidad de transporte de cadmio. ................................................................................................... 37 3.4.4. Evaluar los efectos del Cd tanto a nivel morfológico como en los pigmentos de clorofila en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. ................................................. 37 3.1. Técnicas de procesamiento y análisis de datos. ................................................. 42 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 43 4.1. Cuantificar la concentración de cadmio en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. ............................................. 43 4.1.1. Concentración de cadmio en raíz, tallos y hojas. ................................... 43 4.2. Determinar el factor de translocación (FT) del cadmio en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. ............... 46 4.3. Identificar plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas con menor capacidad de transporte de cadmio ........................... 48 4.4. Evaluar los efectos del Cd tanto a nivel morfológico como en los pigmentos de clorofila en plantones de Theobroma cacao obtenidos por enraizamiento de estaquillas ...................................................................................................... 49 4.4.1. Análisis de efectos del cadmio a nivel morfológico. ............................. 49 4.4.1.1 Longitud de brote evaluado a los 40 y 168 ddt. ....................... 49 4.4.1.2 Número de hojas evaluado a los 40 y 168 ddt. ........................ 53 4.4.1.3 Número de raíces evaluado a los 168 ddt. ............................... 56 4.4.2. Análisis de efectos del cadmio en pigmentos de clorofila. .................... 58 V. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 61 VI. PROPUESTAS A FUTURO ....................................................................................... 62 VII. REFERENCIAS .......................................................................................................... 63 ANEXOS .............................................................................................................................. 70 ÍNDICE DE TABLAS Tabla Página 1. Descripción de los tratamientos estudiados ................................................................ 11 2. Análisis de varianza. ................................................................................................... 11 3. Insumos aplicados durante la etapa de pre-aclimatación. ........................................... 23 4. Temperatura y humedad del sustrato durante 10 días de solarización. ....................... 26 5. Cálculo de la cantidad de CdCl2H2O para las dosis de 6 y 12 ppm. ........................... 28 6. Registros del número de bolsas y cantidad (Kg) de sustrato en las dosis de Cd estudiados. ................................................................................................................... 31 7. Estándares de calibración ............................................................................................ 36 8. Escalas de Factor de translocación citado por (Pachura et al.; 2016) ......................... 37 9. Concentración de Cd en órganos vegetales de los diferentes tratamientos (clon x dosis), según la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. ............................................. 43 10. Factor de traslocación (FT) del Cd de los diferentes tratamientos (clon x dosis), según la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. ........................................................ 46 11. Medias marginales del contenido de Cd (mg Kg -1) en diferentes genotipos. R2m y R2c representan las proporciones de varianza explicadas por el efecto fijo (genotipo) y por el modelo mixto, respectivamente ..................................................................... 48 12. Análisis de varianza para la variable Longitud de brote (cm) evaluada a los 40 y 168 ddt. ............................................................................................................................... 49 13. Efecto principal para clones respecto a la variable longitud de brote, evaluada a los 40 ddt. .......................................................................................................................... 50 14. Efecto principal para dosis respecto a la variable longitud de brote, evaluada a los 40 ddt. .......................................................................................................................... 50 15. Longitud de brote (cm) en los diferentes tratamientos (clon x dosis), evaluados a los 168 ddt. ........................................................................................................................ 51 16. ANVA para la variable Número de hojas evaluado a los 40 ddt y 168 ddt. ............... 53 17. Efecto principal para clones respecto a la variable número de hojas, evaluada a los 40 ddt ........................................................................................................................... 54 18. Efecto principal para dosis respecto a la variable longitud de brote, evaluada a los 40 ddt. .......................................................................................................................... 54 19. Efecto principal para clones respecto a la variable longitud de brote, evaluada a los 168 ddt. ........................................................................................................................ 55 20. Efecto principal para dosis respecto a la variable longitud de brote, evaluada a los 168 ddt. ........................................................................................................................ 55 21. Análisis de varianza para la variable Número de raíces evaluada a los 168 ddt. ........ 56 22. Número de raíces en los diferentes tratamientos (clon x dosis), evaluado a los 168 ddt. ............................................................................................................................... 57 23. Concentración de Clorofila a, Clorofila b y clorofila total de los diferentes tratamientos (clon x dosis), según la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. ............ 59 ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página 1. Imagen satelital de ubicación del vivero – Laboratorio de Biotecnología – EEA El Porvenir. ...................................................................................................................... 9 2. Distribución de las unidades experimentales en el experimento. ............................... 12 3. Identificación de la parte apical de la estaca de cacao a colectarse. ........................... 13 4. Colecta de material vegetal de las estaquillas, a) clones THS 565, CCN 51, ICS 39 e IMC 67), b) Estaquillas de cacao con hojas cortadas en la parte medial, c) Disposición de estaquillas en bolsas negras, d) Acondicionamiento final para su transporte al vivero ...................................................................................................... 14 5. Bandeja forestal conteniendo tubetes con capacidad de albergar a 54 estaquillas ..... 15 6. Desinfección de tubetes, a) Disolución de detergente, b) Lavado de tubetes en solución de detergente y agua, c) Dilución de NaClO al 5 % en agua, d) Lavaje de tubetes en solución de NaClO al 5 % y agua. ............................................................. 15 7. Elaboración de sustrato, a) Sustrato premix, b) Fibra de coco, c) Adición de premix en bandeja, d) Adición de fibra de coco en bandeja, e) Mezcla de premix y fibra de coco, f) Adición de agua a la mezcla de sustrato (premix y fibra de coco). ............... 16 8. Sustrato homogenizado dispuesto en bandejas forestales (tubetes). ........................... 17 9. Lavaje de las estaquillas de cacao en laboratorio........................................................ 17 10. Pesado de fungicida agrícola Flutolamil. .................................................................... 18 11. Proceso de desinfección de estaquillas de cacao, a) Sumersión de estaquillas de cacao en solución desinfectante, b) Aireación de estaquillas de cacao luego de sumergidas en solución desinfectante. ........................................................................ 18 12. Aplicación de hormona AIB a las estaquillas de cacao. ............................................. 19 13. Hoyos para siembra de estaquillas de cacao. .............................................................. 20 14. Estaquilla de cacao sembrada en bandeja forestal. ..................................................... 20 15. Bandejas forestales sembradas con estaquillas de cacao de los clones CCN 51, TSH 565, ICS 39 e IMC 67. ................................................................................................ 21 16. Disposición final de las estaquillas de cacao en micro túnel, a) Acomodo de las bandejas forestales en micro túnel, b) Sellado del micro túnel conteniendo las estaquillas de cacao. .................................................................................................... 21 17. Primeras emisiones de brotes de raíces, a) Estaquilla del clon ICS 39 con primeras emisiones de raíces, b) Estaquilla del clon TSH 565 con primeras emisiones de raíces, c) Estaquilla del clon CCN 51 con primeras emisiones de raíces, d) Estaquilla del clon IMC 67 con primeras emisiones de raíces..................................................... 22 18. Insumos aplicados durante la etapa de preaclimatación. ............................................ 23 19. Aplicación de insumos agrícolas las estaquillas de cacao (pre-aclimatación). ........... 23 20. Colecta de suelo agrícola, a) Toma de muestras de suelo, b) Disposición de muestras de suelo en sacos color negro. ..................................................................................... 24 21. Suelo agrícola, a) Tamizado. b) Esparcido de suelo en camas de cemento. ............... 25 22. Solarización de sustrato, a) 1er envolvimiento con plástico agrícola, b) 2do envolvimiento con plástico agrícola transparente, c) Disposición final del sustrato para su solarización, d) Volteo a 48 horas de iniciado el proceso de solarización. .... 25 23. Medición de Tº y Hº del sustrato con termohigrómetro. ............................................. 26 24. Pesado de suelo agrícola. ............................................................................................ 27 25. Aplicación de agua destilada al suelo agrícola. .......................................................... 27 26. Elaboración de solución de Cd en ppm, a) Pesado del CdCl2H2O, b) Dilución del CdCl2H2O en agua destilada. ...................................................................................... 29 27. Contaminación de sustrato, a) Formación de rumas, b) Adición de CdCl2H2O, c) Sustrato contaminado con Cd para posterior reposo. .................................................. 30 28. Bolsas almacigueras conteniendo sustrato contaminado con Cd. ............................... 30 29. Rotulación de los tratamientos estudiados. ................................................................. 31 30. Hoyo realizado al sustrato con el uso de tubete. ......................................................... 32 31. Disposición final de los tratamientos, a) Trasplante de plantones, b) Siembra de plantones. .................................................................................................................... 33 32. Plantones de cacao distribuidos según tratamientos en vivero. .................................. 33 33. Habilitación de muestras vegetales para análisis en laboratorio, a) Plantones de cacao, b) Segmentación de tejidos vegetales (raíz, tallo y hojas), c) Acomodo de tejidos vegetales en sobres manila, d) Secado de los tratamientos en estudio. ........... 34 34. Evaluaciones morfológicas, a) Evaluación de longitud de brote, b) Conteo del número de hojas, c) Conteo del número de raíces. ..................................................... 38 35. Obtención de muestras para análisis de clorofila. ....................................................... 39 36. Disposición de muestras antes del centrifugado, a) Tubos de centrífuga, b) Tubo de centrífuga conteniendo macerado de hojas. ................................................................ 40 37. Centrifugado de muestras foliares. .............................................................................. 40 38. Lecturas de muestras foliares, a) Disposición en tubos de ensayo, b) Trasferencia a cubeta del espectrofotómetro UV visible, c) Introducción de cubetas al espectrofotómetro UV visible, d) Lectura de absorbancia mediante espectrofotómetro UV visible. .................................................................................... 41 39. Contenido de Cd en órganos vegetales, a) raíz, b) tallo y c) hojas en los tratamientos estudiados (clon x dosis), según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. .......... 44 40. FT de los tratamientos estudiados (clon x dosis), según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. ........................................................................................................... 47 41. Longitud de brote en los clones de cacao CCN 51, IMC 67, ICS 39 y TSH 565 por efecto de tres dosis de Cd (0, 6 y 12 ppm), evaluado a los 168 ddt. ........................... 52 42. Número de raíces en los clones de cacao CCN 51, IMC 67, ICS 39 y TSH 565 por efecto de tres dosis de Cd (0, 6 y 12 ppm), evaluado a los 168 ddt. ........................... 58 43. Concentración de clorofilas, a) Clorofila a, b) Clorofila b y c) Clorofila total de los diferentes tratamientos estudiados (clon x dosis), según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. ........................................................................................................... 59 44. Supervisión del asesor en campo ................................................................................ 71 45. Crecimiento morfológico de los plantones de cacao, a) 40 ddt, b) 1618 ddt .............. 71 RESUMEN El cadmio (Cd) es uno de los metales pesados más tóxicos y representa un riesgo significativo para las plantas, los animales y los seres humanos. Una de las principales preocupaciones para los seres humanos en particular es que los árboles de cacao bioacumulan Cd en niveles más altos que la mayoría de las demás plantas. Este estudio planteó la hipótesis de que los niveles de Cd están influenciados tanto por el contenido de Cd del suelo como por el genotipo del cacao. Se expusieron esquejes de cuatro genotipos de cacao (CCN-51, ICS-39, IMC-67, TSH-565) a dosis de Cd (0, 6, 12 mg/kg) durante 40 y 168 días. Se aplicaron modelos de regresión lineal para evaluar el contenido de Cd de la planta y las respuestas morfológicas y fisiológicas a la exposición al Cd. Los resultados revelaron niveles consistentemente altos de Cd en todos los genotipos, siendo CCN-51 el que mostró la mayor acumulación; sin embargo, se observó una diferencia estadísticamente significativa (P < 0,05) solo entre CCN-51 e IMC-67 en la dosis más alta. Las respuestas morfológicas variaron: el aumento de la dosis de Cd condujo a brotes más largos en CCN-51, ICS-39 y TSH-565, pero brotes más cortos en IMC-67. La dosis de Cd influyó positivamente en el número de raíces en CCN-51 e IMC-67 y en el número de hojas en CCN-51. Si bien se observaron algunas diferencias genotípicas en la acumulación de Cd, todos los genotipos acumularon Cd en niveles inadecuados para el cultivo en suelos contaminados. Estos hallazgos subrayan la necesidad de estrategias alternativas para mitigar la contaminación por Cd en el cultivo del cacao. Palabras claves: CCN-51; IMC-67; ICS-39; TSH-565; Perú; Contaminación del suelo ABSTRACT Cadmium (Cd) is one of the most toxic heavy metals, posing significant risks to plants, animals, and humans. One major concern for humans in particular is that cacao trees bioaccumulate Cd at levels higher than most other plants. This study hypothesized that Cd levels are influenced by both the soil Cd content and cacao genotype. Cuttings from four cacao genotypes (CCN-51, ICS-39, IMC-67, TSH-565) were exposed to Cd doses (0, 6, 12 mg/kg) for 40, and 168 days. Linear regression models were applied to evaluate plant Cd content and morphological, and physiological responses to Cd exposure. Results revealed consistently high Cd levels across genotypes, with CCN-51 showing the highest accumulation; however, a statistically significant difference (P < 0.05) was observed only between CCN-51 and IMC-67 at the highest dose. Morphological responses varied: increasing Cd dose led to longer shoots in CCN-51, ICS-39, and TSH-565 but shorter shoots in IMC-67. Cd dose positively influenced root number in CCN-51 and IMC-67 and leaf number in CCN-51. While some genotypic differences in Cd accumulation were observed, all genotypes accumulated Cd at levels unsuitable for cultivation on contaminated soils. These findings underscore the need for alternative strategies to mitigate Cd contamination in cacao cultivation. key words: CCN-51; IMC-67; ICS-39; TSH-565; Peru; Soil contamination 1 I. INTRODUCCIÓN El sembrío y la producción del cacao están directamente relacionadas con las condiciones medioambientales de las diferentes zonas donde se cultiva, existiendo regiones con mayores niveles de producción como es el caso de San Martín respecto a otras. Durante el período enero a diciembre de 2022, la producción fue liderada por la región San Martín, con 64,9 mil toneladas (representando el 38,1 % de la producción nacional); seguida por la región Junín con 31,9 mil toneladas (18,7 %); Ucayali con 22,7 mil toneladas (13,3 %) y finalmente las regiones de Huánuco y Cusco con 16,6 mil y 8 mil toneladas, respectivamente, constituyéndose de esta forma las cinco regiones en representar alrededor del 80 % de la producción total del país. La producción nacional de cacao en grano en el Perú ha sufrido un crecimiento promedio anual de 10,1 % en los últimos años y esta se basa principalmente en tres variedades, 53,3 % de la variedad trinitario (Junín), 37,3 % de forastero amazónico (Cusco y Ayacucho) y el 9,4 % de criollo (zona norte de San Martín, Amazonas y Cajamarca) (MIDAGRI, 2023). Sin embargo, actualmente el desarrollo de este cultivo viene siendo afectado por algunas limitantes como la presencia de plagas y enfermedades en incluso la presencia de metales pesados de manera natural en los suelos cultivados con cacao como es el caso del cadmio (Cd), hecho que viene limitando su producción y calidad, y por ende la exportación de subproductos vinculados a este cultivo importante en la generación de divisas para diversos actores de la cadena. Augstburger et al; (2000), señalan que las plantas de cacao absorben metales pesados del suelo y los concentran en las semillas, hojas y raíces. Para el caso del cadmio, actualmente, no se conoce un papel fisiológico definido en la planta, pero puede concentrarse en las raíces, brotes, hojas o partes comestibles como los granos por su constitución grasosa (Rascio y Navari-Izzo, 2011). El Cd es un elemento móvil en la solución del suelo y se encuentra de manera natural en la corteza terrestre en forma de minerales, de donde pueden ser absorbidos por las plantas y tomados de ellas por el ser humano, y en altas concentraciones pueden resultar ser tóxicas, según (Prieto et al; 2009). Según Alloway (2013), la presencia de algunos metales pesados está directamente relacionados con fuentes específicas como: fertilizantes (Cd, Cr, Mo, Pb, Zn), plaguicidas (Cu, As, Hg, Pb, Mn, Zn), compost derivados de residuos sólidos convencionales (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn) y del estiércol (Cu, As, Zn). Además, Laegreid et al; (1999) manifiestan que los fertilizantes fosforados son una fuente de Cd, debido a los contenidos de apatita, que además de fósforo, 2 contiene Cd en concentraciones entre 8 y 500 mg/kg, por lo que las plantas expuestas a altos niveles de Cd causan la reducción en la fotosíntesis, en la absorción de agua y nutrientes, consecuentemente, se observa clorosis, inhibición del crecimiento, pardeamiento de las puntas de las raíces y, finalmente, la muerte de la planta (Jiménez, 2015). Así mismo, los grandes mercados consumidores de los derivados de este cultivo, se han vuelto más exigentes. En 2014, la Unión Europea aprobó el reglamento (UE) Nº 488/2014, los cuales regula los umbrales de metales pesados en productos de chocolate y cacao que contienen niveles superiores de 0,8 ppm, situación que podría limitar la dinámica de esta cadena de valor y consecuentemente, afectar a familias y productores que dependen directamente del cultivo de cacao, al disminuir su calidad de vida. En tal sentido, conocer la dinámica del Cd, en plantas de cacao propagadas y producidas asexualmente por enraizamiento de estaquillas podría conllevar a viabilizar las posibilidades de comprender el mecanismo de transporte y translocación de este metal desde el nivel radicular hasta la parte aérea de la planta. Actualmente, la limitada o escasa información científica sobre los mecanismos de transporte de Cd en el cultivo de cacao, genera contextos reducidos que aterricen en posibles soluciones sobre la acumulación de este metal en tejidos y órganos. Es así que, la ejecución de la presente propuesta de investigación buscará entender este mecanismo de transporte desde las raíces hasta la parte foliar (aérea), cuantificando su absorción interna, mediante el análisis por espectrofotometría de absorción atómica. Además, se buscará la identificación de genotipos comerciales con menor afinidad a la translocación de Cd. Consecuentemente, los resultados generados tendrán un impacto para algunos eslabones de esta cadena de valor y en particular para el sector agrícola y la comunidad científica. Para el sector agrícola es muy probable que identifiquemos genotipos comerciales propagados por enraizamiento de estaquillas con menor translocación a cadmio; en tanto que, para la comunidad científica los resultados obtenidos tendrán la veracidad respectiva y existiendo posibilidades de ser publicables en revistas científicas de gran impacto. Finalmente, el desarrollo y ejecución de la presente propuesta de investigación conllevará a fortalecer las líneas de investigación entre la Estación Experimental Agraria EL Porvenir, San Martín del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) y la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS), además, la presente propuesta plantea como hipótesis que la dinámica del cadmio en plantones de Thebroma cacao obtenidas mediante enraizamiento de estaquillas en condiciones de vivero involucra la absorción y translocación del cadmio desde la parte radicular hasta la zona foliar, teniéndose como objetivos: 3 Objetivo general. Determinar la acumulación del cadmio (Cd) en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas en condiciones de vivero. Objetivos específicos. 1. Cuantificar la concentración de Cd en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. 2. Determinar el factor de translocación del Cd en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. 3. Identificar plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas con menor capacidad de transporte de cadmio. 4. Evaluar los efectos del Cd tanto a nivel morfológico como en los pigmentos de clorofila en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. 4 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Descripción morfológica del cacao. Durán (2010), señala que el cacao presenta un sistema radical que se compone de una raíz pivotante y que en condiciones favorables puede penetrar más de 2 m de profundidad en el suelo. Esta condición favorece el reciclaje de nutrientes. Además, presenta un extenso sistema superficial de raíces laterales distribuidas alrededor de 15 cm de la superficie del suelo. Según su origen, la raíz es radicular porque proviene de la radícula del embrión. Además, posee un tallo que crece de forma recta, alcanzando una altura que oscila entre 0,80 a 1,00 m, para luego formar un conjunto de ramas, según refiere Johnson et al. (2008). Después de un año y con una altura de 1,5 m, suele interrumpirse el crecimiento apical, surgiendo 5 yemas laterales que formarán ramas plagiotrópicas dorsiventrales (horquetas), las que se diferencian del brote ortotrópico por las hojas pecioladas. Las hojas adultas poseen una coloración verde, son glabras, presentando una variación de ovada – oblonga a lanceolada, acuminatas con borde liso y nerviación peninervia. La flor del cacao es pedicelada, hermafrodita con 5 sépalos, 5 pétalos, 5 estambres, 5 estaminoides y un ovario pentacarpelar súpero (Benito, 1992). Las inflorescencias son caulinares (se originan del tallo), cimosas o cerradas (IICA, 2017). El fruto, presenta tamaños, colores y formas variables, pero generalmente tienen forma de baya denominada mazorca, pesando aproximadamente 450 g cuando madura, de 30 cm de largo y 10 cm de diámetro, siendo lisos o acostillados, de forma elíptica y de color rojo, amarillo, morado o café. Las semillas son blancas y están compuestas por dos cotiledones, es decir, hojas germinales y un pequeño embrión. Todos estos componentes están encerrados por la cubierta, llamada también testa. Los cotiledones almacenan el alimento para la posterior germinación, así como también las primeras hojas de la planta cuando germina la semilla. Además, las semillas son grandes del tamaño de una almendra, color chocolate o purpúreo, de 2 a 3 cm de largo, presentando también un sabor amargo; no tienen albumen y están recubiertas por una pulpa mucilaginosa de color blanco, con sabor dulce y acidulado. Finalmente, cada semilla contiene una cantidad significativa de grasa (40 – 45 % como manteca de cacao) y su componente activo más resaltante es la teobromina (Durán, 2010). 2.1.1. Clasificación taxonómica del cacao Según (Alverson et al; 1999), el cacao es una especie perenne perteneciente a la familia Malvaceae, cuyo crecimiento demanda el uso de especies de sombra, y la producción de grano sustenta a la industria chocolatera. Coincidentemente (Arguello et al; 5 2000) manifiesta que el cacao pertenece a la familia Malvaceae y al orden Malvales. Por otra parte, Benito (1992), reporta que la planta de cacao presenta la siguiente clasificación taxonómica: Reino : Vegetal División : Spermatophyta Subdivisión : Angiosperma Clase : Dicotiledóneas Orden : Malvales Familia : Esterculáceas Género : Theobroma Especie : Theobroma cacao L. 2.1.2. Propagación asexual del cultivo de cacao: Estaquillas. Este tipo de propagación se realiza por medio de partes vegetativas de la planta seleccionada y no implica un cambio en la constitución genética de la nueva planta debido a que todas las características de la planta madre se presentan en la nueva planta, sin embargo, debido a factores como el clima, tipo de suelo y el ataque de enfermedades pueden modificar la apariencia de la planta, flores o incluso de los frutos sin involucrar un cambio genético. Las estacas o ramillas deben ser obtenidas de las ramas con hojas adultas sanas y presentar una coloración parda, sin flores. Preferentemente las estacas deben ser colectadas por las mañanas, debiendo ser cortadas en el extremo en forma perpendicular a medio centímetro del nudo. Estas deben tener como mínimo tres hojas que se cortarán a 1/3 de la superficie foliar; además las estacas se tratan con hormonas enraizantes antes de la multiplicación (Durán, 2010). Las raíces adventicias de las estaquillas, parte fundamental de este método de propagación clonal, se producen como resultado de la aplicación de altas concentraciones de auxinas (Steffens y Rasmussen, 2016). La aplicación exógena de auxinas, favorece el traslado de carbohidratos, compuestos nitrogenados y otros desde la parte apical hacia la parte basal de la estaca, dando origen y apertura a la etapa de rizogénesis (Puri y Khala, 1992). Para Guan et al.; (2015), la formación de raíces en las estaquillas abraca tres etapas:1) inducción, el cual hace referencia a los eventos químicos y moleculares que preceden a los cambios morfológicos, 2) iniciación, en la cual la división celular permite la formación de primordios y meristemos y 3) extensión, en las cuales las raíces adventicias prosiguen su crecimiento y emergen. Para Enríquez (2004), el método de propagación asexual por medio de estacas o ramillas se basa en la utilización de ramas con hojas adultas sanas y sin flores, cuyas 6 yemas se observen claramente, las cuales son cortadas en el extremo de forma perpendicular y tratadas con fitorreguladores inductores de raíces para la formación de una planta nueva idéntica a la original. Por otra parte, Lima et al; (2001) señala que entre las ventajas que presenta el sistema de propagación por estaquillas sobre otros métodos es que las plantas pueden ser producidas en menor tiempo que las plantas injertadas, además se prescinde del uso de portainjertos, y por tanto los problemas de incompatibilidad entre el injerto y el patrón. Finalmente, es considerado como el método más adecuado para una producción de mayor escala e industrial de plantas de cacao en la actualidad. La eficacia de este método depende de varios factores tales como el tipo de clon de cacao, condición de las estacas, la hormona utilizarse y las condiciones ambientales durante el proceso de propagación y entre las ventajas de este tipo de propagación es que las plantas comienzan a producir precozmente en relación a otras, además las plantas son de poco porte, que bien podadas conforman un buen arquetipo (Benito, 1992). 2.2. Metales pesados: Cadmio (Cd). Un metal pesado puede ser definido como aquel elemento que tiene una densidad superior o igual a 5 g cm-3 cuando está en forma elemental, o cuyo número atómico es superior a 20 (excluyendo los metales alcalinos y alcalino-térreos) (García y Dorronsoro, 2005). Para Alloway (2013), el término metal pesado se ha venido utilizado hace muchos años y es por lo general reconocido como una referencia al grupo de los metales y metaloides de relativamente alta masa atómica (> 5 g cm-3) sobre todo los metales de transición, tales como Pb, Cd y Hg, que pueden causar graves problemas de toxicidad. El Cd es uno de los metales pesados más tóxicos presentes en el ambiente sin comprobada y conocida función fisiológica y biológica en plantas o humanos (Tchounwou et al., 2012; Vanderschueren et al, 2021, Guarín et al: 2024). Además, es considerado un metal pesado no esencial para las plantas (Pinto et al., 2003). Trazas de Cd presente en los suelos pueden conllevar a su acumulación sucesiva en estructuras vegetales comestibles y, en última instancia, migrar a la cadena alimentaria humana (Barraza et al., 2018; Guarín et al., 2024). Los metales pesados más comunes y ampliamente distribuidos como contaminantes ambientales incluyen plomo (Pb), cadmio (Cd), mercurio (Hg) y el metaloide arsénico (As) (Reilly, 2002). 2.2.1. Fuentes de origen del Cd. Existen dos fuentes potenciales de Cd en suelos y plantas. El primero, que se encuentra presente de forma natural en el ambiente, y particularmente en los suelos debido a procesos de erosión que liberan este elemento de los materiales originales que contienen metales pesados (Cd geogénico) (Engbersen et al; 2019; Guarín et al.; 2024). Además, los https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/heavy-metal https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?pes=vor#bb0465 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?pes=vor#bb0505 https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/human-food-chain https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?pes=vor#bb0040 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?pes=vor#bb0040 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0160 7 procesos de transporte y deposición de sedimentos de litologías potencialmente altas en Cd pueden conducir a la acumulación de Cd en suelos aluviales (Capparelli et al; 2020; Chávez et al.; 2015; Gramlich et al; 2018; Guarín et al.; 2024). En segundo lugar, las fuentes de Cd que devienen de las actividades antropogénicas en los suelos y que se relacionan con una amplia gama de industrias vinculadas a la producción de metales pesados (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). Los derivados de las industrias petrolera, minera, textil y agroquímica pueden explicar el alto contenido de Cd y otros metales pesados en el ambiente (Barraza et al; 2018). Las prácticas agrícolas, especialmente de producción a través del uso de fertilizantes fosfatados derivados de rocas ricas en cadmio, también se identifican como una fuente antropogénica de Cd en los suelos (Barraza et al.; 2017; Capparelli et al.; 2020; Chávez et al.; 2015), en tal sentido, las rocas de fosfato destinadas para la producción de fertilizantes son una de las principales fuentes de contaminación por Cd en suelos agrícolas (Mortvedt y Beaton, 1995). Es así que, en las últimas décadas, se registró un aumento significativo de Cd en el ambiente, principalmente como resultado de actividades antrópicas o industriales como la minería, fundición y refinación de zinc, fabricación y uso de fertilizantes fosfatados y fungicidas (Arduini et a.; 2004; Benavides et al.; 2005; Castro et al; 2015). 2.2.2. Mecanismos de trasporte y efectos fitotóxicos del Cd. Las plantas usualmente absorben el Cd que está presente de forma natural en el suelo o procedente de deposiciones atmosféricas , o del presente en fertilizantes orgánicos o fosfatados (Galego et al.; 2012; Castro et al.; 2015). Una vez que ingresa dentro de la planta, la acumulación de Cd genera y cambios morfológicos y ultraestructurales, alteraciones en procesos fisiológicos, bioquímicos y moleculares, modificando como consecuencia las actividades metabólicas (Almeida et al.;2013), por lo que el Cd genera efectos adversos en el crecimiento de la planta, en el proceso fotosintético, en la absorción de nutrientes, en el contenido de pigmentos del cloroplasto, en la expresión genética y en los metabolismos antioxidantes (Pereira de Araújo et al.; 2017), como es caso de las peroxidasas de clase III y el superóxido dismutasa (Almeida et al.;2010). Actualmente, existen evidencias en las cuales se conoce que el árbol del cacao bioacumula Cd a nivel de raíces, hojas, vainas y semillas (Barraza et al.; 2017; Lewis et al.; 2018; Pérez Moncada et al.; 2019; Zug et al.; 2019 ) a un nivel superior al reportado normalmente en otras especies de plantas ( Argüello et al.; 2019; Barraza et al.; 2019; Guarín et al.; 2024). Las plantas captan alrededor de un 75 % de cadmio por vía apoplástica (a través de paredes celulares y espacios intercelulares) y en menores proporciones por vía https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/earth-surface-sediment-transport https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/alluvial-soil https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0090 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0115 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0115 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0225 https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/anthropogenic-source https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/anthropogenic-source https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0255 https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/agrochemical https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0040 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0035 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0035 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0090 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0115 https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/phosphorite https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/phosphorite https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib53 https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/fungicide https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib8 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib13 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib13 https://www.sciencedirect.com/topics/earth-and-planetary-sciences/atmospheric-deposition https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib32 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib5 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651315000470?via%3Dihub#bib5 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0035 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0035 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0275 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0345 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0530 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0030 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0045 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352009424000099?via%3Dihub#bb0045 8 simplástica (a través de paredes celulares y el citoplasma de las células), sin embargo, en especies hiperacumuladoras la toma de este metal es en proporciones iguales tanto por vía apoplástica como por vía simplástica (Zhao et al; 2002). Para Sánchez (2003), el cadmio y la mayoría de los metales pesados incorporados al suelo, pueden seguir cuatro diferentes vías:  Pueden quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la solución del suelo o bien fijados por procesos de adsorción, complejación y precipitación. Estos procesos son importantes ya que el contenido total de cadmio en el suelo da idea del nivel de contaminación, pero es la fracción de cadmio asimilable por la planta, la que indica el grado de toxicidad potencial del elemento para los seres vivos. La fracción del metal considerada asimilable, se define como la suma de la fracción soluble en la fase líquida y la retenida en la fase sólida que puede ser transferida a la solución para ser absorbida por las raíces de las plantas.  Pueden ser absorbidos por las plantas y así incorporarse a las cadenas tróficas.  Pueden pasar a la atmósfera por volatilización.  Pueden movilizarse a aguas superficiales y subterráneas.  Estudios plantean que, los metales pesados podrían ser incorporados por las raíces de las plantas, utilizando mecanismos para la absorción de elementos esenciales (Zn2+, Cu2+, Fe2+, Ca2+ y Mg2+), debido a su similitud química con algunos de estos elementos (Kim et al., 2002). Por otra parte, los efectos fitotóxicos del Cd pueden verse traducidos en la afección de los procesos metabólicos de las plantas, reduciendo la fotosíntesis y la transpiración (Sandalio et al.; 2001). Para Benáková et al; 2017, la toxicidad del Cd en las plantas podría reflejarse en una reducción del crecimiento, de la biomasa y el rendimiento de los cultivos, además de alterar la nutrición mineral, podría generar también una reducción de la fotosíntesis y el cierre estomático, afectar el metabolismo del nitrógeno (N) y la estructura de las membranas, entre otros. 2.3. Genotipos de cacao utilizados en el presente estudio. El genotipo CCN-51 (Colección Castro Naranjal) es un híbrido entre los genotipos IMC-67 y Trinitario cacao ICS-95. Se considera un genotipo universal debido a su adaptabilidad a todas las zonas de producción y su tolerancia a enfermedades como Moniliophthora perniciosa y Moniliophthora roreri (Boza et al; 2014). El genotipo TSH-565 (Trinidad Selected Hybrid) y el ICS-39 (Imperial College Selection) son genotipos que pertenecen al grupo de los Trinitarios (Perea et al.; 2013). El genotipo IMC 67 (Iquitos mezclado con calabacillo), pertenece al grupo Forastero Alto Amazonas (MIDAGRI, 2010). 9 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación del experimento. Los procedimientos vinculados a la propagación y obtención de plántulas de cacao por el método de propagación enraizamiento de estaquillas, se desarrolló dentro de las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología (ver Figura 1) de la Estación Experimental Agraria (EEA) El Porvenir, San Martín, ubicado en el Km 14.5 carretera Fernando Belaunde Terry zona sur, distrito de Juan Guerra, Provincia y Departamento de San Martín, en 354849 m. E y 9271185 m. N. Figura 1. Imagen satelital de ubicación del vivero – Laboratorio de Biotecnología – EEA El Porvenir. 3.2. Equipos y materiales. a) Equipos.  Balanza analítica.  GPS.  Laptop.  Espectrómetro de Emisión Atómica de plasma inducida por microondas MP – AES. 10  Espectrofotómetro UV GENESIS 150.  Termohidrómetro.  Potenciómetro de mano (pH) b) Materiales e insumos.  Tijera de podar.  Hormona AIB.  Etiquetas.  Tijeras.  Sustrato (Premix 3).  Fungicida.  Bandejas forestales.  Bolsas almacigueras 2, 3 y 4 Kg.  Hidrato de cloruro de Cadmio (CdCl2H2O). 3.3. Tipo y nivel de investigación. La investigación fue de tipo paramétrica, descriptiva, generándose nuevos conocimientos (investigación básica). 3.3.1. Diseño de investigación. Se utilizó un Diseño Completamente al azar (DCA) con arreglo factorial de 4 x 3 factores, con 3 repeticiones, donde cada tratamiento estuvo formado por 4 plántulas de cacao obtenidas por enraizamiento de estaquillas, teniéndose en total 36 unidades experimentales. Se estudió dos factores:  Factor A: Clones de cacao, el factor A presentó 4 niveles: - a1: Clon CCN – 51, - a2: Clon IMC – 67, - a3: Clon: ICS – 39 y - a4: Clon TSH – 565.  Factor B: Concentraciones de cadmio (Cd) El factor B presentó 3 niveles: - b1: 0 ppm, - b2: 6 ppm y - b3: 12 ppm. Los tratamientos estudiados se describen a continuación en la Tabla 11 Tabla 1. Descripción de los tratamientos estudiados Tratamientos Descripción Número Clave Clones Concentración de Cadmio T1 a1 x b1 CCN – 51 0 ppm T2 a1 x b2 CCN – 52 6 ppm T3 a1 x b3 CCN – 53 12 ppm T4 a2 x b1 IMC – 67 0 ppm T5 a2 x b2 IMC – 68 6 ppm T6 a2 x b3 IMC – 69 12 ppm T7 a3 x b1 ICS – 39 0 ppm T8 a3 x b2 ICS – 40 6 ppm T9 a3 x b3 ICS – 41 12 ppm T10 a4 x b1 TSH – 565 0 ppm T11 a4 x b2 TSH – 566 6 ppm T12 a4 x b3 TSH – 567 12 ppm a) Modelo matemático. El modelo estadístico que se utilizó en la presente investigación es el siguiente: Yijk = µ + αj + βk + (αβ)jk + єijk Para i = 1, . . . a, j = 1, . . . b, k = 1, . . . n Donde: Yijk = valor estimado de la variable. μ = media general. αj = efecto del factor clones de cacao βk = efecto del factor concentraciones de Cd (αβ)jk = efecto de interacción clones de cacao y concentración de Cd. єijk = efecto del error experimental. b) Análisis de varianza. En la Tabla 2, se presenta el esquema para el análisis de varianza. Tabla 2. Análisis de varianza. Fuentes de variación GL SC CM F Factor A a - 1 SCA CMA= SCA/a-1 FA= CMA/ CME Factor B b - 1 SCB CMB= SCB/b-1 FB= CMB/ CME Interacción AB (a -1) (b -1) SCAB CMAB= SCAB/(a-1)(b-1) FAB= CMAB/ CME Error exp. (ab)(n-1) SCE CME= SCE/(ab)(n-1) Total abn - 1 SCT 12 c) Distribución de unidades experimentales. La unidad experimental consistió en cuatro bolsas, cada una conteniendo una plántula de cacao obtenida mediante la técnica de propagación por enraizamiento de estaquillas. A continuación, se describe la distribución y dimensiones de la unidad experimental: Figura 2. Distribución de las unidades experimentales en el experimento. 3.3.2. Población y muestra. a) Población. La población de estudio estuvo constituida por 144 plántulas, las mismas que fueron establecidos en condiciones de invernadero. b) Muestra. La muestra estará conformada por 4 plantas por tratamiento, todas ellas serán tomadas al azar y en diferentes tiempos de evaluación. 3.4. Metodología A continuación, se detalla la metodología desarrollada para cada objetivo: 3.4.1. Cuantificar la concentración de Cd en plantones de Thebroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. a) Etapa de campo. 1. Identificación del material vegetal (estaquillas de cacao). Constó de partes vegetativas (estaquillas de cacao) correspondiente a los clones CCN – 51 (Colección Castro Naranjal), IMC – 67 (Colección Iquitos mezclado con calabacillo), ICS – 39 (Selección del Colegio Imperial) y el TSH – 565 (Selección Híbrido 13 Trinidad). Las estacas seleccionadas correspondieron al segmento apical de las ramas de la planta de cacao, debido a que en ensayos preliminares realizados en el laboratorio de Biotecnología de la EEA El Porvenir, San Martín, fueron éstas quienes mostraron mayor cantidad de prendimiento (sobrevivencia). Una vez identificada la estaquilla con las características agronómicas deseadas como un adecuado grosor, coloración con tonalidad marrón verduzco, presencia de hojas verdaderas, presencia como mínimo de 4 a 5 yemas axilares vivas y activas, entre otras, luego se procede con la colecta de la misma (ver Figura 3) Figura 3. Identificación de la parte apical de la estaca de cacao a colectarse. 2. Colecta del material vegetal. La colecta (ver Figura 4), se realizó en las primeras horas de la mañana, con el objeto de evitar mayores niveles de estrés (pérdida de humedad) en las estaquillas de cacao colectadas. Estas fueron extraídas de plantas donadoras con buen estado nutricional y agronómico, para ello se utilizó una tijera podadora de mano. Como se mencionó anteriormente y por los motivos explicados, se consideró segmentos apicales al momento de colectar las estaquillas, luego se cortó las hojas verdaderas de las estaquillas en su parte medial, dejando entre tres a cinco hojas cortadas y una longitud de estaquilla de 15 a 20 cm. Luego, las estacas colectadas fueron cuidadosamente dispuestas en bolsas de color negro, acomodándolas una sobre otra, evitando rupturas tanto en hojas como en yemas axilares. Finalmente, éstas fueron acondicionadas y envueltas con papel humedecido (mediante el uso de aspersores conteniendo agua) para evitar desecamiento y estrés por calor y de esta forma mantener su hidratación y luego fueron transportadas al laboratorio y vivero. 14 Figura 4. Colecta de material vegetal de las estaquillas, a) clones THS 565, CCN 51, ICS 39 e IMC 67), b) Estaquillas de cacao con hojas cortadas en la parte medial, c) Disposición de estaquillas en bolsas negras, d) Acondicionamiento final para su transporte al vivero b) Etapa de vivero. 1. Acondicionamiento de materiales, insumos y material vegetal - Limpieza y desinfección de las bandejas forestales. Antes de la siembra de las estaquillas de cacao en las bandejas forestales (tubetes) (Figura 5), se procedió con su desinfección (Figura 6). Esta etapa se realizó dos días entes de la colecta, realizando las siguientes actividades: Se pesó 100 gr de detergente en una balanza analítica, los mismos que fueron disueltos en agua, para ello se utilizó una bandeja con capacidad de 60 L, se mezcló manualmente hasta enrazar y homogenizar la solución. Luego los tubetes, fueron introducidos y lavados, con el objeto de eliminar rastrojos de cualquier insumo que pueda contaminar el sustrato que posteriormente será contenido por los tubetes. A C D B 15 Figura 5. Bandeja forestal conteniendo tubetes con capacidad de albergar a 54 estaquillas Seguidamente, los tubetes fueron introducidos en otra bandeja con capacidad de 60 L, en la cual se mezcló hipoclorito sódico (NaClO) al 5 % y agua, para ello se usó una probeta con el objeto de medir 240 mL de NaClO, cantidad que fue diluida en 60 L de agua. Figura 6. Desinfección de tubetes, a) Disolución de detergente, b) Lavado de tubetes en solución de detergente y agua, c) Dilución de NaClO al 5 % en agua, d) Lavaje de tubetes en solución de NaClO al 5 % y agua. A B C D 16 Luego de homogenizado la solución, los tubetes fueron introducidos durante 10 minutos y después fueron enjuagados en 60 L de agua limpia. Este procedimiento se realizó con la finalidad de eliminar patógenos. - Elaboración de sustrato para ser contenidos en tubetes. El procedimiento constó en enrazar un balde con capacidad de 17 L con sustrato Premix 3 y un balde de la misma capacidad con fibra de coco para ser mezclados en una bandeja de 60 L manualmente y de manera uniforme tratando de eliminar presencia de grumos. Una vez homogenizada la mezcla, procedimos a separar dos baldes de 17 L de la misma, y luego aplicamos gradualmente agua tratando de no sobre humedecer la mezcla, con el objeto de tener un sustrato con adecuada humedad y contextura (Figura 7). Figura 7. Elaboración de sustrato, a) Sustrato premix, b) Fibra de coco, c) Adición de premix en bandeja, d) Adición de fibra de coco en bandeja, e) Mezcla de premix y fibra de coco, f) Adición de agua a la mezcla de sustrato (premix y fibra de coco). La relación proporcional de la mezcla fue 2:1, es decir dos baldes de 17 L de Premix 3, y un balde de la misma capacidad de fibra de coco. Finalmente, el sustrato preparado fue dispuesto luego en los tubetes de las bandejas forestales (Figura 8). A F E D C B 17 Figura 8. Sustrato homogenizado dispuesto en bandejas forestales (tubetes). - Siembra de estaquillas. Después de haber realizado la colecta de estaquillas de cacao, estás fueron conducidas al laboratorio de Biotecnología de la EEA El Porvenir San Martín para un proceso cuidadoso de lavaje, antes de ser sometidas a un tratamiento fitosanitario. Cabe señalar que la etapa de lavaje solo se hizo con agua con la finalidad de no contaminar el material vegetal con algún componente químico que pueda afectar su viabilidad (Figura 9). Figura 9. Lavaje de las estaquillas de cacao en laboratorio. Posteriormente, estas fueron trasladadas al vivero para ser sometidas a un tratamiento fitosanitario a base de fungicida agrícola (Flutolanil, Captan e 18 ingredientes inertes) a una dosis de 2 g/ L de agua por espacio de tiempo correspondiente a 10 minutos con el objeto de desinfectar ante la posible presencia de patógenos a las estaquillas de cacao (Figura 10). Figura 10. Pesado de fungicida agrícola Flutolamil. Luego de pesado los 40 g del fungicida agrícola, éste es mezclado con agua, en un contenedor de plástico conteniendo 20 L de agua. Finalmente, las estaquillas de cada clon de cacao fueron introducidas y sumergidas a la solución desinfectante para realizar el proceso aséptico. Después de 10 minutos de sumersión de las estaquillas de cacao en la solución desinfectante, éstas son aireadas por un lapso de tiempo aproximado de 5 minutos con el objeto de escurrir los sobrantes de la solución desinfectante (Figura 11). Figura 11. Proceso de desinfección de estaquillas de cacao, a) Sumersión de estaquillas de cacao en solución desinfectante, b) Aireación de estaquillas de cacao luego de sumergidas en solución desinfectante. A B 19 Pasado la etapa de desinfección, se procedió con la aplicación de la hormona ácido indol-3-butírico (AIB) a una dosis de 6000 ppm a las estaquillas de cacao, con la finalidad de estimular el enraizamiento de brotes (raíces), para ello se preparó 100 mL de solución, en tal sentido se pesó 0.6 g de AIB en una balanza analítica. Luego, se disuelve el AIB en alcohol de 96° agitando suavemente la solución, hasta que el AIB se haya disuelto por completo. De esta forma, se obtiene una solución de AIB a 6000 ppm, prosiguiéndose a sumergir la parte terminal o basal de las estacas en un recipiente conteniendo la solución hormona antes mencionada, por un espacio de 5 segundos (Figura 12). Para la siembra de las estaquillas de cacao en las bandejas forestales, estas deben tener entre tres a cinco hojas cortadas en su parte medial y como mínimo cuatro yemas axilares vivas y activas. Luego, las estaquillas serán trasladas y sembradas en bandejas forestales, las mismas que contendrán un sustrato enriquecido. Figura 12. Aplicación de hormona AIB a las estaquillas de cacao. Antes de la siembra de las estaquillas de cacao, éstas son separadas por grupos, donde cada clon fue dispuesto en una bandeja forestal rotulado, con la finalidad de evitar confusiones y se hace un remojo ligero del sustrato contenido en los tubetes, para después hacer hoyos con el uso de un lapicero a una profundidad no mayor a 5 cm (Figura 13). 20 Figura 13. Hoyos para siembra de estaquillas de cacao. Después, la siguiente etapa consistió en la siembra de las estaquillas de los cuatro clones (CCN 51, TSH 565, ICS 39 e IMC 67) previamente colectadas y acondicionadas, en los tubetes de las bandejas forestales, procediendo con los dedos de la mano a ejercer suavemente cierta presión a la parte basal de las estaquillas para darle estabilidad al ser sembrada (Figura 14). Figura 14. Estaquilla de cacao sembrada en bandeja forestal. 21 Luego, las bandejas forestales que contuvieron las estaquillas de cacao fueron dispuestos en micro túneles (previa limpieza del micro túnel con agua y detergente) (Figura 15). Figura 15. Bandejas forestales sembradas con estaquillas de cacao de los clones CCN 51, TSH 565, ICS 39 e IMC 67. Además, el micro túnel contó con riego automatizado (agua entubada, captada de quebrada), con la finalidad de garantizar la humedad y condiciones favorables para el desarrollo de las plantas, luego el micro túnel fue sellado con el uso de cinta de embalaje (Figura 16). Durante esta etapa, las plantas permanecieron en el micro túnel aproximadamente entre 40 a 60 días con temperaturas que oscilaron entre 29º +/- 3 ºC y una humedad relativa del 80 %, en las cuales se podrá observar el desarrollo de las primeras raíces (ver Figura 17). Figura 16. Disposición final de las estaquillas de cacao en micro túnel, a) Acomodo de las bandejas forestales en micro túnel, b) Sellado del micro túnel conteniendo las estaquillas de cacao. A B 22 Figura 17. Primeras emisiones de brotes de raíces, a) Estaquilla del clon ICS 39 con primeras emisiones de raíces, b) Estaquilla del clon TSH 565 con primeras emisiones de raíces, c) Estaquilla del clon CCN 51 con primeras emisiones de raíces, d) Estaquilla del clon IMC 67 con primeras emisiones de raíces. Pasado este tiempo las plantas fueron sometidas a un proceso de preaclimatación que consistió en dos etapas: La primera dentro del micro túnel, donde alrededor de una semana el micro túnel gradualmente fue abierto, es decir, el primer día el micro túnel fue abierto por espacio de tiempo de 1 hora, el segundo día 2 horas, y así sucesivamente hasta completar la semana, cabe señalar que la frecuencia de riego dentro del micro túnel se mantuvo, es decir los aspersores se activaban cada 15 minutos en cada intervalo de hora, regando a las estacas por un espacio de tiempo de 1 minuto. La segunda etapa consistió en sacar las bandejas forestales conteniendo las estaquillas de cacao a las mesas metálicas del vivero, con cobertura de sombra (malla Raschel) del 80 %, manteniéndose la misma frecuencia de riego. Durante el proceso de preaclimatación se hizo en promedio cuatro aplicaciones de fertilizantes foliares (semanal), con el objeto de aumentar la vigorosidad de las plantas. Los productos (ver Tabla 3 y Figura 18) y dosis utilizadas se detallan a continuación: A B C D 23 Tabla 3. Insumos aplicados durante la etapa de pre-aclimatación. Nombre comercial Descripción Dosis utilizada Quimifol 600 plus Fertilizante foliar: NPK 20-20-20. Micronutrientes: (Fe), (Cu), (Mn), (Zn), (B), (Mo) vitamina B1, sustancias húmicas. 37.5 gr Quimifol pH máster Fertilizante foliar: ácido fosfórico, materiales inertes. 7.5 ml Sportak Fungicida sistémico: grupo químico Imidazoles. 15 ml Silwet Coadyuvante 15 ml Enzipron Bioestimulante: nitrógeno orgánico, carbono orgánico, Ácido fólico 37.5 ml * La mención de productos comerciales, se hizo con fines informativos y no implica necesariamente una recomendación expresa del autor. Figura 18. Insumos aplicados durante la etapa de preaclimatación. Luego, las dosis de cada producto fueron diluidos en 15 litros de agua, y posteriormente aplicados a las plántulas de cacao mediante mochila fumigadora de 20 L (Figura 19). Finalmente, la etapa de preaclimatación tuvo una duración aproximada de 20 días. Figura 19. Aplicación de insumos agrícolas las estaquillas de cacao (pre-aclimatación). 24 Posteriormente, las plantas iniciaron un proceso de aclimatación propiamente dicho en vivero por un tiempo aproximado de 60 días y fuera del microtúnel, donde se observó mayor cantidad de raíces y la formación de las primeras hojas verdaderas. Para ello, las bandejas conteniendo los tubetes fueron trasladas a otra área del vivero y dispuestas sobre mesas metálicas y en las cuáles recibieron un 50 % de entrada de luz y otro 50 % de sombra. Se continuó con las mismas dosis y frecuencia de aplicación de los fertilizantes foliares aplicados durante la etapa de pre-aclimatación, los mismos que contenían macro y micronutrientes, con la finalidad de aportar al vigor de las plantas. 1. Contaminación de sustrato con CdCl2H2O para ser dispuestos en bolsas almacigueras.  Obtención del sustrato (Suelo aluvial) Para este propósito, se procedió a realizar la colecta del suelo. El lugar de muestreo fue el distrito de Pucacaca, provincia de Picota. Se trató de un suelo aluvial, con plantas de cacao en producción. Para esta actividad, se utilizó palanas y sacos de color negro (Figura 20). Después de haber realizado la colecta del suelo, este pasó por un proceso de tamizado para eliminar rastrojos, ramillas o impurezas. Luego de culminado el tamizado del suelo, este fue esparcido dentro de las camas de cemento con el objeto de evaporar la humedad y mejorar su aireación (Figura 21). Figura 20. Colecta de suelo agrícola, a) Toma de muestras de suelo, b) Disposición de muestras de suelo en sacos color negro. Después de haber realizado la colecta del suelo, este pasó por un proceso de tamizado para eliminar rastrojos, ramillas o impurezas. Luego de culminado el tamizado del suelo, este fue esparcido dentro de las camas de cemento con el objeto de evaporar la humedad y mejorar su aireación (Figura 21). A B 25 Figura 21. Suelo agrícola, a) Tamizado. b) Esparcido de suelo en camas de cemento. Seguidamente, se desinfectó el suelo colectado, y para ello, fue sometido a un proceso de solarización (Figura 22) con el objeto de minimizar la presencia de fitopatógenos y plagas agrícolas que pudiesen afectar el desarrollo de las plántulas de cacao. Se utilizó plásticos de color celeste y plástico agrícola para envolver el suelo a plenitud de las horas sol y por espacio de 7 horas al día. Este proceso duró aproximadamente 14 días. Posteriormente, el sustrato fue sometido a varios volteos después de las 48 horas de iniciado la solarización con las medidas asépticas correspondiente con el objeto de no contaminarlo, luego este proceso se repitió diariamente, con la finalidad de homogenizar el proceso de desinfección. Durante el proceso de solarización se registró dos parámetros importantes que condicionan este proceso como son la temperatura y humedad del sustrato mediante el uso de un termohigrómetro (ver Figura 23). Los datos de temperaturas y humedad del sustrato se registran en la Tabla 4. Figura 22. Solarización de sustrato, a) 1er envolvimiento con plástico agrícola, b) 2do envolvimiento con plástico agrícola transparente, c) Disposición final del sustrato para su solarización, d) Volteo a 48 horas de iniciado el proceso de solarización. A B A B C D 26 Figura 23. Medición de Tº y Hº del sustrato con termohigrómetro. Tabla 4. Temperatura y humedad del sustrato durante 10 días de solarización. Culminado el proceso de solarización, se aperturó la etapa de contaminación del sustrato con hidrato de cloruro de cadmio, para esta finalidad se calculó la capacidad de campo del mismo. Se pesó en una balanza electrónica 1 Kg de sustrato, que luego fue dispuesto en un recipiente de plástico trasparente (Figura 24). Después, con la ayuda de una probeta se fue añadiendo agua destilada de manera gradual, adicionándose en total 100 mL, Nº Días Temperatura Humedad Tº mín. Tº máx. Hº mín. Hº máx. Día 1 33 ºC 35ºC 45 % 64 % Día 2 35 ºC 39 ºC 38 % 50 % Día 3 32 ºC 38 ºC 43 % 61 % Día 4 31 ºC 38 ºC 39 % 65 % Día 5 36 ºC 37 ºC 36 % 42 % Día 6 36 ºC 46 ºC 25 % 45 % Día 7 34 ºC 40 ºC 30 % 51 % Día 8 30 ºC 34 ºC 59 % 64 % Día 9 35 ºC 41 ºC 32 % 46 % Día 10 35 ºC 36 ºC 36 % 50 % 27 hasta homogenizar la mezcla, y tener una contextura adecuada (sin exceso de humedad) (Figura 25). Este procedimiento se llevó a cabo en las instalaciones y con el apoyo del equipo técnico del Laboratorio de suelos, aguas y foliares de la EEA El Porvenir, San Martín. Cabe señalar que, solo se usó este tipo de suelo para tratar de asemejar el criterio de los productores de la zona. Figura 24. Pesado de suelo agrícola. Figura 25. Aplicación de agua destilada al suelo agrícola. Seguidamente, se procedió con la contaminación del sustrato y para este fin, se procedió de la siguiente manera: Las dosis empleadas en el experimento fueron 0, 6 y 12 ppm de Cd. En ese sentido se procedió a realizar los siguientes cálculos matemáticos (Tabla 5). 28 Tabla 5. Cálculo de la cantidad de CdCl2H2O para las dosis de 6 y 12 ppm. Procedimientos Valores numéricos y unidades Peso molecular del CdCl2H2O 201.32 g/mol Peso molecular del Cd 112.41 g/mol Pureza del CdCl2H2O 112.41*100/201.32 = 55.8 % Cantidad de CdCl2H2O para diluir en 1 L de H2O. Para 1 ppm se necesita 1000 mg Cd. 201.31 g CdCl2H2O/112.41 g Cd = 1.79 g CdCl2H2O Se necesita 1.79 g CdCl2H2O para 1 ppm de Cd en un 1 Kg suelo, entonces se disolvió 1.79 g CdCl2H2Oen un 1 L de H2O. Cantidad de sustrato a contaminar (cantidad de sustrato que se necesitó para ambas concentraciones de Cd fue de 120 kg). Para 6 ppm: 1Kg suelo……6 ppm 120 Kg suelo…………X X = 720 ml Cd Para 12 ppm: 1 Kg suelo…..12 ppm Cd 120 Kg suelo…………X X = 1 440 ml Cd Capacidad de campo 1 Kg suelo……………100 ml H2O 120 Kg suelo…………X X= 12 000 ml = 12 L volumen total (Cd + H2O) Volumen de H2O para 6 ppm 12 000 mL – 720 mL Cd= 11 280 mL H2O Volumen de H2O para 12 ppm 12 000 mL – 1 440 mL Cd= 10 560 mL H2O Cálculo de las cantidades de H2O y Cd para 15 Kg de suelo H2O para 6 ppm 120 Kg suelo………11 280 mL H2O 15 Kg suelo………X X= 1 410 mL H2O Cd para 6 ppm 120 Kg suelo………720 mL Cd 15 Kg suelo………X X= 90 mL Cd H2O para 12 ppm 120 Kg suelo………10 560 mL H2O 15 Kg suelo………X X= 1 320 mL H2O 29 Cd para 12 ppm 120 Kg suelo………1 440 mL Cd 15 Kg suelo………X X= 180 mL Cd Después de culminar los cálculos matemáticos para determinar las dosis, se procedió posteriormente con el pesado del hidrato de cloruro de cadmio en gramos y con el uso de una balanza analítica, para su posterior dilución con agua destilada (ver Figura 26). Seguidamente, se procedió con la contaminación del sustrato (ver Figura 27), en tal sentido, se pesó 8 veces cantidades ascendentes a 15 kg de suelo, para facilitar la manipulación de la solución y el sustrato, completándose así los 120 kg de suelo en total, luego se construyó 8 rumas de 15 kg sobre una mesa de cemento recubierta por plástico de color negro para proceder a la aplicación de las dosis y de manera manual proceder a la mezcla. Se agregó 1 410 mL de H2O destilada y 90 mL de Cd para una dosis de 6 ppm, mezclándose el sustrato de manera uniforme hasta acabar la solución, este proceso se repitió hasta completar los 120 kg de suelo. La misma secuencia se hizo con la dosis de 12 ppm. Figura 26. Elaboración de solución de Cd en ppm, a) Pesado del CdCl2H2O, b) Dilución del CdCl2H2O en agua destilada. Una vez formado las rumas, se procedió a añadir las soluciones de Cd, tanto para 6 y 12 ppm. Conforme se adicionó las dosis de Cd, se procedió a mezclar manualmente conservando las condiciones de asepsia y seguridad el sustrato y la solución hasta A B 30 uniformizar la mezcla, después se procedió con el reposo del sustrato contaminado con Cd por espacio de 15 días. Durante este periodo fue el sustrato contaminado con Cd fue recubierto con plástico de color negro. Figura 27. Contaminación de sustrato, a) Formación de rumas, b) Adición de CdCl2H2O, c) Sustrato contaminado con Cd para posterior reposo. Culminado este proceso, se continuó con el llenado de las bolsas almacigueras con el sustrato contaminado con Cd. Las mismas, tuvieron una capacidad de hasta 3 Kg (Figura 28). En la Tabla 6, se muestra el número de bolsas y la cantidad de sustrato utilizados para los tratamientos estudiados. Figura 28. Bolsas almacigueras conteniendo sustrato contaminado con Cd. A B C 31 Tabla 6. Registros del número de bolsas y cantidad (Kg) de sustrato en las dosis de Cd estudiados. Dosis (ppm) Sustrato (Kg) Nº de bolsas 0 120 48 6 120 48 12 120 48 Total 360 144 Seguidamente, las bolsas almacigueras fueron etiquetadas con cinta masking y rotuladas con plumón indeleble color rojo para un mejor monitoreo y dispuestas en bandejas rectangulares de tres colores: 12 ppm (verde), 6 ppm (rojo), y 0 ppm (celeste) (Figura 29). Luego se procedió con el trasplante de las plántulas de cacao obtenidas por enraizamiento de estaquillas de los cuatro clones en estudio desde las bandejas forestales a las bolsas almacigueras, por lo que, fue necesario realizar hoyos con la ayuda de los tubetes al sustrato contaminado con Cd contenido en las bolsas almacigueras (Figura 30). Figura 29. Rotulación de los tratamientos estudiados. 32 Figura 30. Hoyo realizado al sustrato con el uso de tubete. Este hecho permitió que las raíces de las plántulas calcen adecuadamente con el sustrato contaminado con Cd dentro de las bolsas almacigueras (Figura 31). Los hoyos tuvieron una profundidad de 10 cm. Este procedimiento se desarrolló cuando las plántulas tenían alrededor de 110 a 120 días de edad, es decir cuando ya emitieron brotes nuevos (raíces y hojas). Finalmente, luego de realizado el trasplante de todas las plántulas de cacao de los cuatro clones estudiados a las bolsas almacigueras, éstas fueron trasladas y dispuestas en el vivero del Programa Nacional Café y Cacao de la EEA El Porvenir (Figura 32), donde se continuó con el experimento hasta culminar todas las evaluaciones morfológicas y fisiológicas. Durante este período las plántulas fueron abastecidas únicamente con agua destilada y semanalmente, con el objeto de no contaminarlas, impedir su deshidratación y evitar la contaminación del sustrato que contenía Cd. 33 Figura 31. Disposición final de los tratamientos, a) Trasplante de plantones, b) Siembra de plantones. Figura 32. Plantones de cacao distribuidos según tratamientos en vivero. c) Etapa de laboratorio.  Determinación de las concentraciones de cadmio en raíces, tallos y hojas en plántulas de cacao obtenidas por enraizamiento de estaquillas. A B 34 Después de haber culminado todas las evaluaciones morfológicas, se procedió a determinar las concentraciones de Cd, procediéndose a habilitar las muestras vegetales (Figura 33), por lo que fue necesario sacrificar las plántulas de cacao de los cuatro clones estudiados, luego se colectó mediante el uso de una tijera de podar manual debidamente desinfectada muestras de tejidos vegetales como raíz, tallo y hojas. Además, las partes colectadas (raíz, tallo y hojas) pasaron por un proceso de limpieza. Las muestras de tejidos vegetales fueron colocadas en sobres de papel, los mismos que estuvieron debidamente etiquetadas para su posterior secado en estufa a una temperatura de 75 ºC durante 72 horas en el laboratorio y someterlos a un proceso de molienda. Figura 33. Habilitación de muestras vegetales para análisis en laboratorio, a) Plantones de cacao, b) Segmentación de tejidos vegetales (raíz, tallo y hojas), c) Acomodo de tejidos vegetales en sobres manila, d) Secado de los tratamientos en estudio. A C D B 35 Finalmente, todas las muestras de tejidos vegetales se enviaron al laboratorio de suelos, aguas y foliares de la EEA El Porvenir para su respectivo análisis mediante espectrofotometría de emisión atómica de plasma por microondas (MP- AES). Se procedió a cuantificar concentración de Cd en raíces, tallos y hojas en los genotipos de cacao estudiados. El análisis de espectrofotometría, se basó en el método de determinación de Metales Totales en Suelos por MP-AES (Cd), teniéndose como referencia a la norma NTP ISO/ IEC 17025, Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de prueba y calibración. Además, la lectura de Cd se rigió en las metodologías: a) EPA Method 3050B. Revision 2. 1996. Acid Digestion of Sediments, sludges and soils y b) EPA Method 6010D. Revision 5. 2018. Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry, a continuación, se detalla los procesos de pretratamiento, digestión y lectura de las muestras:  Pesamos 0.50 g ± 0.01 g muestra de tejido vegetal seco y luego lo transferimos al vaso o tubo de digestión.  Añadimos 5.0 ± 0,1 mL de ácido nítrico (1:1), después mezclamos la suspensión y cubrimos con una luna de reloj o tapa del tubo de digestión. Procedimos luego a calentar la muestra a 95 °C ± 5°C y reflujar durante 10 a 15 minutos sin hervir. Después, enfriamos la muestra y agregamos 2.5 mL de HNO3 concentrado, luego volvimos a tapar y reflujar durante 30 minutos. En caso de generase humos marrones (oxidación de la muestra por HNO3) se debe repetir la adición de 2.5 mL de HNO3, hasta que la muestra no emita humos marrones (reacción completa con HNO3). Seguidamente, usando una luna de reloj o tapa de digestión, se dejó que la solución se evapore.  Después de haber completado el paso anterior agregamos 1 mL de agua y 1.5 ml de H2O2 al 30 %, después se cubrió el recipiente con una luna de reloj o tapa del tubo digestión y devolvimos el recipiente cubierto a la plancha de calentamiento o Hotblock para calentarlo y comenzar luego la reacción del peróxido. Se debe tener cuidado para asegurar que no ocurran pérdidas debido a efervescencia excesivamente vigorosa. Después, calentamos hasta que desaparezca la efervescencia y dejamos enfriar el recipiente.  Seguidamente, se continuó agregando H2O2 al 30 % en alícuotas de 1 ml con calentamiento hasta que la efervescencia sea mínima o hasta que la apariencia general de la muestra no cambie. No se debe adicionar más de 10 mL H2O2.  El siguiente proceso consistió en cubrir la muestra con una luna de reloj o tapa del tubo de digestión y se continuó calentando el digerido de peróxido ácido hasta que el volumen se 36 haya reducido a aproximadamente 5 ml o también es válido calentarlo a 95 °C ± 5 °C sin hervir durante dos horas. Finalmente, mantuvimos una cubierta de solución sobre el fondo del recipiente en todo momento.  Luego se agregó 5 mL HCl concentrado al digerido de muestra y cubrimos con una luna de reloj o tapa de tubo de digestión. Después se colocó la muestra sobre/dentro de la fuente de calor y refluimos a 95 C ± 5 °C durante 15 minutos.  Después de enfriar, se diluyó a 50 mL con agua. Luego, las partículas en el digestado fueron eliminados mediante filtración, centrifugación y permitiendo que la muestra se asiente.  Diluimos luego y se volvió a analizar las muestras que superen el rango lineal de un analito (o especies necesarias para una corrección).  Para realizar las lecturas una vez listas las muestras digestadas se enciende el equipo Espectrómetro de Emisión Atómica de plasma inducida por microondas MP - AES marca Agilent modelo 4210.  Luego se ingresó al software del equipo MP Expert versión 1.6.2.12109, donde nos mostró todas las partes del equipo y del control de gases para el funcionamiento del mismo.  Luego se colocó en el autosample para la curva de calibración, los estándares de Cadmio (Cd), donde se observó la formación de la curva de calibración (Tabla 7) para cada estándar junto con la intensidad que alcanza. Tabla 7. Estándares de calibración Tubo Etiqueta de disolución Cd 228.802 ppm 1 Blanco 0.0000 2 Estándar 1 0.1000 3 Estándar 2 0.5000 4 Estándar 3 1.0000 5 Estándar 4 2.0000 3.4.2. Determinar el factor de translocación del Cd en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. Cabe señalar que, el FT indica la capacidad que tiene la planta para translocar el metal desde la parte radicular hasta la parte aérea. Para la determinación y cálculo del factor de translocación (FT), las concentraciones obtenidas de Cd mediante espectrofotometría de emisión atómica de plasma por microondas (MP-AES) en cada órgano de la planta, fueron utilizadas para los cálculos matemáticos, según la fórmula adaptada por (Pachura et al.; 2016): FT= Concentración de metal pesado parte aérea (hojas) Concentración de metal pesado parte raíz 37 La bioacumulación define la capacidad de la planta para acumular metales pesados, teniendo en cuenta su contenido de sustrato inicial. Cuánto mayor sean los valores que adquiere, mayor es la concentración del elemento se encuentra en la biomasa vegetal en comparación con su contenido de sustrato inicial. En la Tabla 8, se muestra la escala de cuatro grados del FT, la misma que fue considerada para efectos de interpretación en la presente investigación como base para evaluar y analizar la bioacumulación de Cd. Tabla 8. Escalas de Factor de translocación citado por (Pachura et al.; 2016) Escala Descripción < 0.01 No hay acumulación 0.01 – 0.1 Baja bioacumulación 0.1 – 1.0 Bioacumulación media > 1.0 Bioacumulación alta 3.4.3. Identificar plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas con menor capacidad de transporte de cadmio. Según los reportes y análisis de los datos obtenidos por espectrofotometría de emisión atómica de plasma por microondas (MP-AES) del laboratorio de suelos, aguas y foliares de la EEA El Porvenir, se procedió a identificar los clones que muestren menor afinidad a la translocación del cadmio, seleccionando los genotipos tolerantes y susceptibles a este metal pesado. El reporte de los clones con menor afinidad al Cd fue presentado en el capítulo resultados del presente trabajo de investigación. 3.4.4. Evaluar los efectos del Cd tanto a nivel morfológico como en los pigmentos de clorofila en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas.  Análisis de efectos del Cd a nivel morfológico. Se evaluó como variables morfológicas (Figura 34) la altura o longitud de brotes en centímetros (cm), mediante el uso de una regla metalizada teniendo en cuenta la parte basal hasta la parte apical, además se contó el número de hojas emitidas por las plántulas de cacao. Estas variables fueron evaluadas en intervalos de tiempo de 40 y 168 días después del trasplante (ddt) de las plántulas a las bolsas almacigueras que contenían el sustrato contaminado con Cd. Al final se sacrificó las plántulas de cacao con el objeto de evaluar el número de raíces al culminar el ensayo (168 días después del trasplante ddt). 38 Figura 34. Evaluaciones morfológicas, a) Evaluación de longitud de brote, b) Conteo del número de hojas, c) Conteo del número de raíces.  Análisis de efectos del Cd en pigmentos de clorofila. Se evaluó el contenido de clorofila a, clorofila b y clorofila total en el tejido foliar de las plántulas de cacao obtenidas por enraizamiento de estaquillas. Para esta finalidad, se realizó las siguientes actividades:  Se procede con la desinfección y esterilizar los materiales de vidrio que fueron utilizados (tubos de ensayo de 15 mL y tubos de centrífuga de 50 mL).  El proceso de esterilización de los materiales de vidrio, se hizo mediante el uso de una estufa a una temperatura de 50 ºC por un periodo de 2 horas.  El material vegetal (hojas), fue colectado de la parte central de la plántula. Se determinó un plantón por tratamiento.  La obtención de las muestras (Figura 35), se inició con la colecta de las hojas a través del uso de una tijera de podar previamente desinfectado, después estas son guardadas en sobre de manila, rotulados y correctamente identificados. Además de ello, la figura presenta las siguientes divisiones: a) Hojas colectadas para medición de clorofilas, b) Envases de plástico rotulados donde se dispuso las muestras de hojas, c) Envases de plástico rotulados conteniendo las muestras de hojas, d) Pesado de hojas para análisis de clorofilas, e) A B C 39 Molienda de las muestras de hojas para análisis de clorofilas, f) Adición de CaCO3 a la molienda de las muestras de hojas. Figura 35. Obtención de muestras para análisis de clorofila.  Posteriormente, las hojas fueron lavadas con agua destilada y cuidadosamente secadas con franelas limpias y luego son dispuestas en recipientes de plásticos limpios que fueron previamente rotulados.  Seguidamente, en una placa petri, se procedió a pesar 1 gr de hojas frescas y sin nervaduras en una balanza analítica de precisión.  Luego colocamos las hojas cortadas y pesadas en un mortero de porcelana y procedimos con la molienda de las hojas, macerándolas con 20 mL de etanol al 96 %, posteriormente añadimos a la molienda una pequeña cantidad de carbonato de calcio (CaCO3), es decir la punta de una espátula.  Después, se dejó reposar el macerado por 2 minutos para luego transferirlo con el uso de una pipeta graduada a los tubos de la centrífuga (Figura 36). A B C D E F 40 Figura 36. Disposición de muestras antes del centrifugado, a) Tubos de centrífuga, b) Tubo de centrífuga conteniendo macerado de hojas.  Luego centrifugamos el macerado por 3 minutos a 1000 (RFC) o fuerza G (Figura 37). Figura 37. Centrifugado de muestras foliares.  Seguidamente, vertimos 8 mL de etanol de 96 % en los tubos de ensayo y adicionamos 2 mL de la muestra centrifugada, luego se agitó la solución con el objeto de uniformizarla.  Hecha la dilución se dio inicio a la etapa de lectura de las muestras (Figura 38), para ello transferimos la solución a una cubeta del espectrofotómetro UV visible para la lectura de absorbancia. A B 41  Luego, la absorbancia se leyó a 649, 665 y 654 nm de longitud de onda. Para cada lectura se equilibró el instrumento previamente con un blanco del solvente (etanol 96 %). Figura 38. Lecturas de muestras foliares, a) Disposición en tubos de ensayo, b) Trasferencia a cubeta del espectrofotómetro UV visible, c) Introducción de cubetas al espectrofotómetro UV visible, d) Lectura de absorbancia mediante espectrofotómetro UV visible.  Finalmente, la cantidad de clorofila presente en el extracto y tejido correspondiente fue calculada con las siguientes ecuaciones: mg Clor. a / g PF= [13.7(D665) - 5.76 (D649)] * V/1000* W mg Clor. b / g PF= [25.8(D649) – 7.60 (D665)] * V/1000* W mg Clor.a+ b / g PF= [6.10(D665) + 20.04 (D649)] * V/1000* W mg Clor. total / g PF= D654*1000/39.8* V/1000* W A B C D 42 Donde: D: densidad óptica del extracto leído a longitud de onda indicado. V: volumen final del extracto alcohólico. W: peso de la muestra del tejido verde. 3.1.Técnicas de procesamiento y análisis de datos. Los datos generados fueron procesados en hojas de cálculos Excel, además para el análisis e interpretación de los mismos, se utilizó un análisis de varianza (ANVA), y un test de comparación de medias (Duncan, P ≤ 0,05), usando el software estadístico R (R versión 4.4.1., R Core Team, 2024). Asimismo, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Finalmente, mediante el software para Sistemas de Análisis de Varianza – SISVAR (Ferreira, 2011). 43 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Cuantificar la concentración de Cd en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. 4.1.1. Concentración de cadmio en raíz, tallos y hojas. Las concentraciones de Cd en raíces, tallos y hojas se presentan en la Tabla 9 y Figura 39. Además, fueron sometidas a pruebas de verificación de supuestos, normalidad y homocedasticidad, utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene respectivamente. Posteriormente, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, acompañada del ajuste de Holm para comparaciones múltiples, dado a que los datos no cumplieron con estos supuestos. Tabla 9. Concentración de Cd en órganos vegetales de los diferentes tratamientos (clon x dosis), según la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. Valores promedios (n = 3). Diferencias significativas (p < 0.05) usando Kruskal test. Letras diferentes indican diferencias significativas. Nuestros resultados, según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para la concentración de Cd en las raíces, evidencian que el tratamiento T3 (CCN 51 x 12 ppm) reporta la mayor concentración del metal pesado, con un valor promedio de 28.23 mg kg-1, superando estadísticamente a los tratamientos T12 (TSH 565 x 12 ppm) y T9 (ICS 39 x 12 ppm) quienes concentraron un promedio de 17.88 mg kg-1y 17.51 mg kg-1 de Cd respectivamente, no existiendo además diferencias estadísticas significativas en ambos tratamientos. Contrariamente, el tratamiento T1 (CCN 51 x 0 ppm) obtuvo la menor concentración de Cd en Clon Dosis (ppm) Cd Raíz (mg kg-1) Cd Tallo (mg kg-1) Cd Hojas (mg kg-1) CCN 51 0 0.05 ± 0.01 d 0.04 ± 0.01 d 0.08 ± 0.09 d 6 9.32 ± 11.56 abcd 7.43 ± 6.56 abcd 14.25 ± 15.81 abcd 12 28.23 ± 9.50 a 27.32 ± 12.97 a 35.15 ± 7.05 a IMC 67 0 0.20 ± 0.04 cd 0.14 ± 0.03 cd 0.26 ± 0.03 cd 6 10.31 ± 6.01 abcd 11.74 ± 5.34 abcd 18.65 ± 2.38 abc 12 11.92 ± 1.47 abc 13.52 ± 5.89 abc 21.13 ± 2.92 abc ICS 39 0 0.93 ± 1.44 bcd 0.84 ± 1.23 bcd 0.32 ± 0.11 bcd 6 15.92 ± 8.11 abc 29.74 ± 18.84 a 34.52 ± 13.14 a 12 17.51 ± 6.86 ab 27.40 ± 11.45 a 28.29 ± 11.80 ab TSH 565 0 1.29 ± 1.62 bcd 0.42 ± 0.33 bcd 0.52 ± 0.38 bcd 6 15.99 ± 8.38 abc 21.17 ± 8.67 ab 25.07 ± 13.42 abc 12 17.88 ± 8.38 ab 23.45 ± 10.56 a 20.84 ± 16.07 abc 44 raíces, con un valor promedio de 0.05 mg kg-1. Para la concentración de Cd en los tallos, nuestros resultados sugieren que, los tratamientos T8 (ICS 39 x 6 ppm), T9 (ICS 39 x 12 ppm), T3 (CCN 51 x 12 ppm), T12 (TSH 565 x 12 ppm) y T11 (TSH 565 x 6 ppm) obtuvieron las mayores concentraciones de Cd, con valores promedios de 29.74 mg kg-1, 27.40 mg kg-1, 27.32 mg kg-1, 23.45 mg kg-1 y 21.17 mg kg-1 respectivamente, no existiendo diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos. En contraste, el tratamiento T1 (CCN 51 x 0 ppm) mostró los niveles más bajos en la concentración de Cd, con un valor promedio de 0.04 mg kg-1. Figura 39. Contenido de Cd en órganos vegetales, a) raíz, b) tallo y c) hojas en los tratamientos estudiados (clon x dosis), según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Finalmente, la mayor concentración de Cd en hojas, se evidencia en los tratamientos T3 (CCN 51 x 12 ppm) y T8 (ICS 39 x 6 ppm) con promedios de 35.15 mg kg-1 y 34.52 mg kg-1 respectivamente, no existiendo diferencias estadísticas significativa en ambos tratamientos. Por el contrario, el tratamiento T1 (CCN 51 x 0 ppm) fue el que reportó el menor contenido de Cd en hojas, con un valor promedio de 0.08 mg kg-1. Estos hallazgos, difieren con los encontrados por Arévalo-Hernández et al.; (2020) quienes realizaron un experimento en vivero con 53 genotipos de cacao silvestres y domesticados, con el objeto de evaluar su repuesta al Cd en términos de crecimiento y acumulación del metal pesado y nutrientes esenciales. En tal sentido, reportan que los clones 45 ICS 39, CCN 51 y TSH 565 son genotipos de baja concentración de Cd a nivel de brotes (tallos y hojas). Por el contrario, en nuestro estudio se reporta que dichos genotipos acumulan altas concentraciones de Cd, presentando mayor tolerancia al metal, contexto que podría vincularse a la presencia de la proteína TcNRAMP5 responsable de desempeñar un papel en la regulación de la absorción de Cd en plantas de cacao (Ullah et al.; 2018; Moore et al.; 2020). Posiblemente, esta proteína también influenció en el comportamiento fisiológico de los genotipos ICS 39, CCN 51 y TSH 565, al activar niveles de tolerancia al Cd, permitiendo su bioacumulación. Sin embargo, la información sobre la función específica de los genes transportadores en plantas de cacao es todavía limitada, así como los mecanismos reguladores de la translocación del Cd a los demás compartimentos de la planta, según Fernández – Paz et al.; (2021). Algunas especies o genotipos de plantas pueden tolerar altas concentraciones de metales pesados en el suelo al impedir que estos elementos entren en las raíces o mediante su volatilización a través de las estomas (Peer et al.; 2005; He et al.; 2015), sin embargo, este no es el caso para los genotipos de cacao del presente estudio, porque nuestra investigación advierte que las concentraciones de Cd en las plántulas de cacao estudiadas fueron directamente proporcionales al aumento de las dosis de Cd en el suelo utilizado como sustrato, en tal sentido, estos hallazgos se alinean con otros estudios en las cuales reportan que entre el 50 y el 72 % de la variaciones en las concentraciones de Cd en los granos de cacao se explican por la concentración de Cd disponible en el suelo (Chávez et al;, 2015; Ramtahal et al.; 2015; Gramlich et al.; 2018; Argüello et al.; 2019). Asimismo, la influencia de factores ambientales como temperatura, humedad relativa y horas de sol podrían influir también en los resultados. Las conclusiones sobre los contenidos de Cd en las diferentes partes de las plantas de cacao varían considerablemente entre los autores, en ese sentido, Barraza et al.; (2017), reportaron los contenidos más alto de Cd en las hojas, en comparación con la cáscara de la mazorca o los granos. Contrariamente, Chávez et al; (2015), informaron que los contenidos más altos de Cd se encontraron en los frutos y las concentraciones más bajas en las hojas. En un estudio controlado Correa et al.; (2021) observaron concentraciones de Cd más bajas en comparación con nuestros hallazgos, es decir, para una concentración de Cd en el suelo de 10 mg Kg-1 reportaron concentraciones foliares que oscilaron entre 13.55 ± 2.46 y 20.52 ± 2.26 mg Kg-1. Asimismo, Zacariyya et al; (2022), informaron niveles de Cd de 4.86 mg Kg-1 en raíces y 13.53 mg Kg-1 en brotes a una concentración de Cd de 8 ppm. Además, Arévalo- Hernández et al. (2020) documentaron una concentración de Cd significativamente menor de 0.43 ± 0.02 mg Kg-1 en brotes (tallos y hojas) del clon CCN 51 cuando se sometieron a 25 mg Kg-1 de contaminación de Cd en el suelo. Finalmente, nuestro estudio registró valores 46 considerablemente más altos en los genotipos de cacao estudiados cuando se expusieron a 12 ppm de contaminación por Cd, con concentraciones promedio de 18.88 mg Kg-1 en raíces, 22.92 mg Kg-1 en tallos y 26.35 mg Kg-1 en hojas. 4.2. Determinar el factor de translocación (FT) del Cd en plantones de Theobroma cacao obtenidos mediante enraizamiento de estaquillas. El factor de traslocación del Cd de los tratamientos estudiados, se presentan en la Tabla 10 y Figura 40. Complementariamente, el factor de traslocación fue sometido a pruebas de verificación de supuestos, normalidad y homocedasticidad, utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene respectivamente. Posteriormente, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, acompañada del ajuste de Holm para comparaciones múltiples, dado a que los datos no cumplieron con estos supuestos. Tabla 10. Factor de traslocación (FT) del Cd de los diferentes tratamientos (clon x dosis), según la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. Clon Dosis FT CCN 51 0 ppm 2.71 ± 2.31 a 6 ppm 3.27 ± 1.15 a 12 ppm 2.24 ± 0.20 a IMC 67 0 ppm 2.08 ± 0.49 a 6 ppm 3.54 ± 1.88 a 12 ppm 2.99 ± 1.06 a ICS 39 0 ppm 3.59 ± 3.09 a 6 ppm 4.16 ± 0.44 a 12 ppm 3.18 ± 0.84 a TSH 565 0 ppm 1.24 ± 0.63 a 6 ppm 2.98 ± 0.30 a 12 ppm 2.43 ± 0.49 a FT = Factor de translocación Valores promedios (n = 3). Diferencias significativas (p < 0.05) usando Kruskal test. Letras iguales indican que no hubo diferencias significativas. 47 Figura 40. FT de los tratamientos estudiados (clon x dosis), según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Teniendo en cuenta que el FT expresa la capacidad de los genotipos de cacao seleccionados para transportar Cd desde la raíz a las partes aéreas (De Almeida et al.,2022), podemos advertir que las plántulas estudiadas, particularmente del genotipo ICS 39 (Tabla 10) inoculados a la dosis media de Cd (6 ppm), exhibieron una mayor translocación de Cd desde las raíces a las partes aéreas. Según Mingorance et al.; (2007), un FT > 1, indica que los órganos de la planta de cacao están enriquecidos con Cd. En nuestro estudio, según la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, no existió diferencias estadísticas significativas entre los trat