UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS TESIS “HUELLA DE MACROELEMENTOS, MICROELEMENTOS, PLOMO Y CADMIO, COMPUESTOS BIOACTIVOS Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN GRANO FRESCO, SECO Y PASTA DE CACAO” Para optar el título de: INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Presentado por: TOLENTINO SANTILLÁN, María Estela Promoción 2017 - I TINGO MARÍA – PERÚ 2018 DEDICATORIA Al Dios Eterno, por su Provisión y sustento durante la culminación de mi carrera profesional A mis padres: TOLENTINO QUINTO, Máximo Tomás y SANTILLÁN MEJÍA, Marilúz, por su cariño y apoyo incondicional, ser mi motor y motivo para hacer de mí una profesional. Porque ellos caminaron conmigo durante años de estudios, con la perseverancia, resistencia y sin doblegar a las dificultades hasta lograr el objetivo trazado. AGRADECIMIENTO - A la Universidad Nacional Agraria de la Selva, a la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias a través de todos los catedráticos, que formaron aportaron con mi formación profesional. - Al Programa Innóvate Perú, por cofinanciar el proyecto de investigación, innovación, para incrementar la productividad empresarial, a través de concursos nacionales integrados. - A la Cooperativa Agraria Cafetalera la Divisoria Ltda. Al Coordinador proyecto PITEI-1-P-220-065-14 ING. PEDRO CAMASCA PIÑAN, por su confianza para desarrollar la investigación “Tesis” dentro del proyecto “ESTABLECER UN BANCO DE PLANTAS MADRES DE CACAO CON MENOR TASA DE ASIMILACIÓN DE CADMIO EN EL VALLE DEL ALTO HUALLAGA”, al equipo de profesionales, Ing. SÁNCHES CLAUDIO Carmen, Ing. BARRAZA SANDOVAL Laura, Ing. SARAVIA CASTILLEJOS Lesly, por todo su apoyo. - Al Dr. PELÁEZ SÁNCHEZ Pedro Pablo, Investigador de la CAC la Divisoria Ltda. y a su vez asesor de la presente tesis, por su continua dedicación y asesoramiento en la elaboración del proyecto y ejecución. - Al Ing. NEYRA TRUJILLO Gilmer, por su asesoramiento y apoyo durante la investigación relacionado a los análisis de MINERALES en el Laboratorio de suelos de Agronomía. - A los Ingenieros REATEGUI DÍAZ Darlym y PÉREZ PELÁEZ Sissy Meryll, por su asesoramiento y apoyo durante la investigación relacionado con los análisis de compuestos funcionales y Actividad Antioxidante en el CIDBAM. - A la Sra. RIVERA HUAYTA Guillermina y familia, por su afecto, apoyo, consejos y acogerme siendo como una madre. - A todos mis amigos que colaboraron de una y otra manera para la culminación del presente trabajo de investigación en especial a: IGLESIAS ESPINOZA Arquímedes, RIOS REATEGUI Humberto, RUIZ MACEDO Jack Edward, AUCCA ECHARRE Julián, SANGAMA SOTO Wilson Jairo, VÁSQUEZ RIOS Marví Lía, QUIROZ CASTILLO Flor, entre otros. A todos los mencionados y a los que por involuntaria omisión no aparecen en esta lista, de verdad, a todos MUCHAS GRACIAS. INDICE Pagina RESUMEN I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 3 2.1. Antecedentes .......................................................................................... 3 2.2. Aspectos generales de cacao ................................................................. 5 2.2.1. Origen y distribución geográfica del cacao ................................... 5 2.2.2. Clasificación taxonomía ................................................................ 5 2.2.3. Manejo poscosecha y benedicio del cacao .................................. 6 2.2.4. Composición química del grano fresco ......................................... 7 2.2.5. Composición química del grano fermentado y seco ..................... 8 2.2.6. Composición química de la pasta de cacao ................................. 9 2.2.7. Proceso de la obtención de las muestras de cacao .................. 10 2.3. Aspectos generales de minerales ....................................................... 12 2.3.1. Los macroelementos .................................................................. 12 2.3.2. Los microelementos .................................................................. 13 2.3.3. Metales pesados .................................................................... 14 2.4. Generalidades de los compuestos bioactivos .......................................... 16 2.4.1. Polifenoles totales ..................................................................... 16 2.4.2. Las antocianinas ........................................................................ 17 2.5. Capacidad antioxidante ......................................................................... 18 2.5.1. Ensayo de actividad antioxidante sobre el radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) .................................................................. 19 2.5.2. Ensayo de actividad antioxidante sobre sobre el radical 2,2′- azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico) (ABTS0+) .......... 20 2.5.3. Equivalente de trolox ................................................................... 20 III. MATERIALES Y METODOS ........................................................................ 22 3.1. Lugar de ejecución ................................................................................ 22 3.2. Muestras de grano de cacao ................................................................ 22 3.3. Materiales, equipos y reactivos utilizados ............................................. 26 3.3.1. Materiales de laboratorio .……..……..…………………………. 26 3.3.2. Equipos de laboratorio y/o procesos..………….………….……. 26 3.3.3. Reactívos y solventes ………………..………….………….……. 27 3.3.4. Otros……………………..……………..……….…………….……. 27 3.4. Método de análisis ................................................................................ 28 3.5. Metodología experimental……………………………….…..……………..29 3.5.1. Preparación del extracto por digestión ácida – vía húmeda para el análisis de macroelementos, microelementos cadmio y plomo .30 3.5.2. Determinación de cadmio (Cd), plomo (Pb), cobre (Cu), hierro (Fe) Y manganeso (Mn), en los granos frescos, secos y pasta de cacao……………………………………………..…………………..32 3.5.3. Determinación de fósforo (P) en los granos frescos, fermentados y pasta de cacao …..………..….……………………………………...……..35 3.5.4. Determinación de Sodio (Na) y Zinc (Zn)…………….……….…..36 3.5.5. Determinación de Calcio (Ca), Magnesio (Mg), Potasio (K)…..…37 3.5.6. Preparación del extracto hidroalcohólico para los análisis de compuestos bioactívos y capacidad antioxidante de los granos frescos, secos y pasta de cacao ...................................... …………………..38 3.5.7. Cuantificación de polifenoles totales ………………………..……39 3.5.7. Cuantificación de antocianinas……..………………………..……41 3.5.6. Determinación de capacidad antioxidante en los granos frescos, secos y pasta de cacao ............................................................. 42 V. RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................ 48 5.1. Análisis general de los contenidos de minerales en las muestras muestras..................................................................................................48 5.2. Contenidos de macroelementos fosforo (P), sodio (Na), calcio (Ca) y magnesio (Mg) en las muestras..............................................................52 5.3. Contenidos de cobre (Cu), hierro (Fe), Zinc (Zn) y manganeso (Mn) en las muestras............................................................................................60 5.4. Contenidos de cadmio (Cd) y plomo (Pb) de las muestras….….…........67 5.5. Contenido de polifenoles totales, antocianinas y capacidad antioxidante en los granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao..72 VI. CONCLUSIONES ...................................................................................... 80 VII. RECOMENDACIONES .............................................................................. 82 VIII. ABSTRACT …………………………………..……......…..……………………83 IX. REFERENCIAS BIBLIOBGRAFICAS ........................................................ 85 X. ANEXO………...….. .................................................................................... 95 INDICE DE CUADROS Pagina 1. Composición fisicoquímica promedio de los granos frescos de cacao... ...... 8 2. Composición química de las almendras fermentadas y secas......................9 3. Composición química de la pasta de cacao... ............................................. 10 4. Datos de las 31 muestras, considerando sector, códigos, variedad y ubicación geográfica ……………..………………………………………..……25 5. Parámetros de calibración del espectrofotómetro de absorción y emisión atómica Cd,Pb, Cu, Fe, Mn .................................................................... ...34 6. Parámetros para la elaboración de la curva patrón de fósforo………………………………….…………………………………………36 7. Parámetros de calibración del equipo para determinar Na y Zn .…………37 8. Parámetros de calibración del equipo para determinar Ca, Mg y K ………38 9. Concentraciones utilizadas en la elaboración de los estándares de AG, para realizar la curva patrón de los polifenoles totales ……………………………40 10. Contenido de macroelementos en los granos frescos secos de las muestras (n = 3) …………………………………………………………………54 11. Contenido de macroelementos en las muestras fermentadas secas. 55 12. Contenido de macroelementos en las muestras de pasta de cacao ………56 13. Contenido de Microelementos en los granos frescos secos …………….…61 14. Contenido de Microelementos en los granos fermentados secos …………62 15. Contenido de Microelementos en las muestras de pasta de cacao………..63 16. Metales Pesados en los granos frescos secos, fermentados secos y pasta de cacao ( ± DS, ppm, n=3)….…….…………………….……………………68 17. Polifenoles Totales (PPT, g AGE/100 g), Antocianinas Totales (ANT, mg Cianidina- 3-Glucósido/100 g) en las muestras ………………….……….…….……………73 18. Capacidad Antioxidante en los granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao (µM ET/g) ( ± DS). ………………………………………………………75 INDICE DE FIGURAS Pagina 1. Diagrama de proceso de la obtención de pasta de cacao ........................ 11 2. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante.19 3. Estructura del ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante ..20 4. Datos de las 31 muestras, considerando sector, códigos, variedad y ubicación geográfica .............................. …………………………………….. 24 5. Flujograma para la obtención de las muestras en granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao …………………….………………..…..31 6. Diseño experimental para determinar contenidos de minerales, compuestos funcionales y capacidad antioxidante en las muestras ………….…………..46 7. Biplot del ACP, PC1 (53%) y PC2 (24%), que explican la relación entre muestras (granos frescos secos, fermentados secos y pasta de cacao) y contenido de minerales……………...………………….………………….........50 8. Gráfico de la Influencia de las muestras en el componente principal 1 ……51 9. Biplot del ACP, PC1 (97%) y PC2 (1%), que explican la relación entre minerales en granos frescos secos, fermentados secos, pasta de cacao y muestras ………………………………………………………………….………53 10. Biplot del ACP, PC1 (96%) y PC2 (2%), que explican la relación entre macroelementos en granos frescos secos, fermentados secos, pasta de cacao y las 12 muestras seleccionadas ……..…………………………..….....59 11. Biplot del ACP, PC1 (92%) y PC2 (4%), que explican la relación entre microelementos cubre (Cu), hierro (Fe), zinc (Zn) y manganeso (Mn) en las 12 muestras seleccionadas………………..……………………..……………..66 12. Biplot del ACP, PC1 (99%) y PC2 (1%), que explican la relación entre contenido de cadmio (Cd), y las muestras…………………………. …….…..70 13. Biplot del ACP, PC1 (70%) y PC2 (18%), que explican la relación entre contenido de plomo (Pb), y las muestras …………………….……. …….…..71 14. Grafica de puntajes del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que explican la relación entre las variables de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas .78 15. Grafica de cargas del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que correlaciona las muestras y que explican la afinidad de características entre ellas, en el análisis de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas ……..…….79 RESUMEN Se han investigado treinta y un muestras de granos de cacao (Theobroma cacao L.) frescos secos (GFRS), 31 de granos fermentados secos (GFS) y 31 muestras de pasta de cacao (PC); procedentes del Alto Huallaga, área de influencia de la Cooperativa Cafetalera Divisoria; determinándose los macroelementos fosforo, sodio, calcio y magnesio; los microelementos cobre, hierro, zinc, manganeso; los metales pesados cadmio, plomo; se determinó el contenido de polifenoles totales, antocianinas, capacidad antioxidante (CA) como 2,2-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin- 6-sulfonico (ABTS), expresados como equivalente de trolox (ET). Resulto que el calcio fue el mineral con el mayor contenido en la muestra M26 de GFRS, con 3,14%; considerando el potasio (K1) en GFRS, el mayor contenido lo tubo la muestra M13, con 2,44%. De igual modo el ACP estableció que 12 muestras influyeron en los CP1 y CP2, en el ACP general de minerales y muestras. El ACP (96%) estableció que el zinc (Zn1) en los GFRS, se encontraba en mayor cantidad en M30, M22, M23 y M9; con 90,46 ± 0,19 ppm en M30. 25 muestras en cada tipo, alcanzaron no más de 0,61 ± 0,01 ppm de cadmio; valor menor al establecido por la CEU. El contenido de plomo fue mayor en los GFRS, en la M20 con 3,44 ± 0,05 ppm y menor en M22 con 1,33 ± 0,05 ppm; el menor contenido de Pb lo presento la muestra M15, de PC con 0,20 ± 0,02 ppm. Se encontró que la muestra M10, de GFRS, presentó la mayor CA en función a los radicales ABTS y DDPH (GFRS), con valores de 591,50 ± 3,76 y 513,68 ± 0,84 µM ET/g; también se determinó que la muestra M19 de PC, presentó la mayor CA en función al radical ABTS, con el valor de 412,34 ± 2,26 µM ET/g. 1 I. INTRODUCCION Los árboles de cacao se siembran principalmente en África occidental, América del Sur, Asia. Ghana, Indonesia, Nigeria, Brasil, Ecuador, México y Perú aproximadamente el 90% de la producción mundial de cacao según IMCO (2015). Perú cuenta con óptimas condiciones naturales para el cultivo del cacao. Más del 90% de la producción mundial de las semillas de cacao (Theobroma cacao), proviene de la variedad Forastero, mientras que el mejor cacao se produce principalmente a partir de las variedades Criollo y Nacional (AFOAKWA, 2010). Las variedades de cacao que cultivan los socios de la Cooperativa Agraria Cafetalera La Divisoria Ltda., son Criollo, Común, CCN-51, ICS-95, Criollo Morado, entre otras variedades. Los macroelementos son los minerales que necesitamos a diario en cantidades del orden de gramos por día, son el Na, K, Cl, P, Ca, Mg y S (BAKIRCIOGLU et al., 2016) y los microelementos o elementos traza, son sustancias inorgánicas que aparecen en el cuerpo en diminutas cantidades, pero son esenciales para la salud. La mayoría de los microelementos (Cu, Fe, Mn, Mg, Se y Zn) desempeñan un papel vital como parte estructural en muchas enzimas (GHARIBZAHEDI et al., 2017); estos elementos también se encuentran en los granos de cacao, por lo tanto, van a estar presentes en el proceso de fermentación, secado, obtención de pasta o licor de cacao; llegando finalmente a los productos comerciales que se elaboran a base de licor de cacao, influyendo en la calidad nutritiva y sensorial. De igual modo existen metales pesados como 2 el plomo y el cadmio, los cuales son elementos tóxicos para la salud, cuya presencia en los granos de cacao disminuye su calidad (OVACO Y PINEDA, 2011), estos compuestos como los polifenoles, antocianinas, teobromina, cafeína, catequinas, también se encuentran en los granos de cacao. Los elementos minerales y compuestos funcionales enunciados en los párrafos anteriores aún no han sido debidamente investigados en los granos de cacao, de las diversas variedades que se cultivan en la zona del Alto Huallaga y el país, lo cual motivó el desarrollo de la investigación, considerando como objetivo general determinar la huella de diversos minerales, compuestos funcionales, capacidad antioxidante en grano fresco, seco y pasta de cacao; con los objetivos específicos: Aplicar el análisis de componentes principales (ACP) para evaluar el contenido de minerales y relación con las muestras; de igual modo al contenido de macroelementos fosforo, potasio, sodio, calcio y magnesio; de microelementos cobre, hierro, zinc, manganeso; a los metales pesados cadmio, plomo y al contenido de polifenoles totales, antocianinas, capacidad antioxidante (DPPH, ABTS), en granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao. 3 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. Antecedentes DANIELA et al. (2016), han reportado que el contenido de 56 macro, micro y trazas de 61 granos de cacao producidos en 23 países de África Oriental y Occidental, Asia y América Central y del Sur usando ICP-MS y prueba la eficacia y robustez de un nuevo enfoque quimiométrico de trazabilidad geográfica desarrollada sobre la base de perfiles elementales. El modelo basado en los 29 elementos (Ag, As, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, Ga, Hg, K, Li, Mg, Mn, Na, Rb, Se, Sr, Th, Tl, U, Y y Zn) indicada como la más predictiva por el análisis discriminante proporcionó una discriminación óptima entre los 5 orígenes subcontinentales, logrando el 100% de la reclasificación correcta. BARTOSZ KRUSZEWSKI et al. (2017), estudiaron un enfoque integral de la contaminación por metales pesados cadmio (Cd), plomo (Pb), níquel (Ni), en cacao y en las masas resultantes de los diversos pasos del proceso de fabricación del chocolate en tres empresas diferentes. Este estudio proporcionó datos nuevos y confiables para autoridades de seguridad alimentaria, partes interesadas y consumidores. También amplío el conocimiento de la contribución hecha por materias primas particulares, procesos de producción y máquinas en el nivel general de estos metales en el producto final. 4 La reducción total observada en los niveles de metales variados según la línea de producción 10,5 - 33% Cd, 0 - 100% Pb, 11 - 42% Ni. El níquel fue el metal tóxico más abundante (máximo 12,1 mg / kg en el cacao en bruto y 4,5 mg / kg en el chocolate) y su presencia crea un grave riesgo para la salud de los niños. El chocolate obtenido de uno de los productores presentó un peligro similar en términos de su contenido de cadmio (0,43 mg / kg). Por lo tanto, los productos de chocolate se deben monitorear constantemente y se debe establecer un límite absoluto con respecto a los niveles permisibles de metales pesados. RAMÍREZ et al. (2013), determinaron la capacidad antioxidante y contenido de grasa de clones de cacao, provenientes de especies nativas del Estado de Chiapas, México. Utilizaron extractos de 34 muestras de semillas de cacao diluidas en metanol al 95% y clasificadas según pH en tres grupos: I (5,52- 5,90), II (5,91- 6,28) y III (6,29-6,67). El Grupo I con menor pH, mostró menor contenido calórico (26,3±3,6% de grasas), con la mejor actividad antioxidante con menor valor EC50 de 4182 ppm y mayor contenido de polifenoles 6,6±0,32 equivalentes de ácido gálico por 100 g de muestra seca. SUDHIR et al. (2005), reportaron el contenido de níquel, plomo y cadmio en 69 diferentes marcas de chocolates y dulces disponibles en los mercados locales de las zonas suburbanas de Mumbai, India. El nivel de cadmio varió de 0,001 a 2,73 µg / g con un promedio de 0,105 µg / g. El níquel varió de 0,041 a 8,29 µg / g con un promedio de 1,63 µg / g. El nivel de plomo varió de 0,049 a 8,04 µg / g con un promedio de 0,93 µg / g. Los chocolates a base de cacao se encontraron con mayores contenidos de los metales pesados. 5 2.2. Aspectos generales de cacao 2.2.1. Origen y distribución geográfica del cacao ANECACAO (2009), menciona que el cacao (Theobroma cacao), es una especie endémica de América del sur cuyo centro de origen está localizado en la región comprendida entre las cuencas de los ríos Caquetá, Putumayo y Napo, tributarios del río Amazonas. En la cuenca amazónica, se distribuye en Bolivia, Brasil, Colombia, Venezuela, Surinam y Guyana. En la selva peruana se cultiva en los Departamentos de Loreto, San Martín, Ucayali, Huánuco, Junín, Pasco, Madre de Dios, Cuzco y Ayacucho. ICT (2004), indicó que algunos investigadores han señalado que el centro primario de diversidad del cacao se encuentra en la región nororiental de Perú; sin embargo, la existencia de una gran diversidad de poblaciones silvestres y nativas dispersos en la región central y sur de la Amazonía Alta, apoyaría la hipótesis de que el centro de origen no solo estaría confinado a dicha región, sino que además incluiría la región centro y suroriental del Perú; las cuencas de los ríos Huallaga, Ucayali y Urubamba. 2.2.2. Clasificación taxonomía Según RIERA (2009), La ubicación taxonómica de la especie es: Reino: Plantae (plantas) División: Magnoliophyta (plantas con flores, ansgiospermas) Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas) 6 Subclase: Dilleniidae Orden: Malvales Familia: Sterculiaceae Género: Theobroma Especie: Cacao L. 2.2.3. Manejo postcosecha o beneficio del cacao El beneficio del cacao se puede definir como la serie de operaciones sucesivas que comienzan con la cosecha y apertura de las mazorcas maduras para la obtención de los granos (desgrane), continúa con la fermentación, secado y limpieza, terminando con la selección, clasificación y almacenamiento del grano (ÁLVAREZ, 2004). El proceso de beneficio contempla dos pasos: la fermentación y el secado. En este, el cacao se prepara como materia prima para la industria, además es el proceso que mayor influencia tiene en el desarrollo de los precursores del sabor y aroma a chocolate; de esta manera se acondiciona el cacao para su comercialización a nivel nacional e internacional y define la calidad final (RECALDE, 2007). Fermentación: La fermentación de los granos de cacao es la combinación de reacciones microbianas y enzimáticas que ocurren en la pulpa., en la cual ocurren dos fenómenos importantes durante la fermentación: el primero es la actividad microbiana en la pulpa mucilaginosa, con producción de alcohol y ácidos que libera calor, el segundo son las complejas reacciones bioquímicas en el interior de los cotiledones iniciadas productos del metabolismo 7 de la pulpa. Entonces, la fermentación del cacao se produce en dos fases; la primera se denomina anaerobia y la segunda denominada aerobia (LIMA et al., 2011). En ellas intervienen diferentes grupos de levaduras, bacterias ácido lácticas y bacterias ácido acéticas, principalmente (SCHWAN y FLEET, 2015). Uno de los métodos de fermentación considera la utilización durante el proceso, de cajones sencillos construidos con tablones de maderas finas, resistentes a la humedad, tales como: el cedro o el nogal, y otras de tipo blando, que carecen de resinas y no desprenden sustancias extrañas que interfieran en la calidad final del grano. Para cubrir el cajón se utilizan hojas de plátano o sacos de yute, además de la cubierta del cajón (ÁLVAREZ, 2004). Secado: El contenido de humedad en los granos fermentados es alrededor del 55%, pero para un almacenamiento seguro debe bajar a menos del 7%, durante el secado continúan las reacciones iniciadas en la fermentación, sigue disminuyendo el amargor y la astringencia de los polifenoles, se completan los cambios de color en las almendras; en los cotiledones, se observa un color pardo o canela. Por esto, el contenido de humedad debe disminuir lentamente, en un lapso de 5 a 7 días, cuando se hace al sol (NTP, 2006). 2.2.4. Composición fisicoquímica del grano fresco Según RODRÍGUEZ (2001), reportó que los granos de cacao fresco estaban constituidos por lípidos cuyo contenido fueron significativamente diferentes según cada variedad de cacao (Cuadro 1). 8 2.2.5. Composición química del grano fermentado y seco Según WACAO (2002), la composición química de los granos de cacao (Cuadro 2) depende de varios factores como: tipos de cacao, origen geográfico, grado de madurez, calidad de fermentación secado y el beneficio de poscosecha. Cuadro 1. Composición fisicoquímica promedio de los granos frescos de cacao. Componente % Humedad 36,86 pH 6,36 Acidez titulable 0,31 Taninos 0,80 Azúcares reductores 3,24 Azúcares totales 8,07 Proteína 13,59 Ceniza 3,59 Grasas 49,52 Fuente: Rodríguez (2011). 9 Cuadro 2. Composición química de las almendras de cacao fermentadas y secas. Componente Fermentado y seco (%) Cáscara (%) Germen o radícula Agua 5,00 4,50 8,50 Grasa 54,00 1,50 3,50 Cafeína 0,20 - - Teobromina 1,20 1,40 - Polihidroxifenoles 6,00 - - Proteína bruta 11,50 1,90 25,10 Mono oligosacáridos 1,00 0,10 2,30 Almidón 6,00 - - Pentosa 1,50 7,00 - Celulosa 9,00 26,50 4,30 Ácidos carboxílicos 1,50 - - Otras sustancias 0,50 - - Cenizas 2,60 8,00 6,30 Fuente: CALDERON (2002). 2.2.2. Composición química de la pasta de cacao La composición química de la pasta de cacao puede ser afectada por diversos factores como la variedad, el clima, el suelo y otros (Cuadro 3) 10 Cuadro 3. Composición química de la pasta de cacao. Componente Porcentaje (%) Grasa 55 Carbohidratos 17 Proteínas 11 Teobromina 1,5 Fuente: Hernández (2010) 2.2.3. Proceso de la obtención de las muestras de cacao Según DIAZ y PINOARGOTE (2012), para la obtención de pasta de cacao se utiliza en el siguiente diagrama de proceso, tal como se muestra en la Figura 1. • Limpieza: Los granos llegan con una serie de impurezas como granos pequeños, vanos, materia extraña (piedras, hojas, tierra, etc), siendo necesarias la eliminación para conservar la calidad del producto (HERNANDEZ, 2010). • Tostado: Se tuestan para ayudar el desarrollo de todas las cualidades aromáticas y de sabor a temperaturas comprendidas entre 100 y 150 °C/20 a 40 minutos. Posteriormente las almendras son enfriadas por ventilación, para detener las reacciones térmicas y conservar su aroma. Las principales reacciones químicas que se desarrollan durante el tostado son: las reacciones de maillard, la caramelizarían de los azúcares, la degradación de las proteínas y la síntesis de compuestos azufrados (PORTILLO, et al., 2009). 11 Figura 1. Diagrama de proceso de la obtención de pasta de cacao • Enfriamiento: Se enfría a 25°C/20 min aproximadamente para que no haya una pérdida de aroma (HERNANDEZ, 2010). • Descascarillado: Es el proceso en el que se elimina la cáscara la cual constituye la cubierta exterior de la semilla de cacao de forma manual (LIENDO, 2005). • Molienda: Los nibs son molidos para producir la pasta de cacao, La temperatura y la intensidad de moliendo fluctúa según el tipo de semilla empleada y de las especificaciones del diseño exigido para el producto final (LIENDO, 2005). Granos de cacao fermentados y secos 4°C min Enfriamiento Descascarillado Molienda Conchado Almacenado Limpieza Tostado Granos pequeños, achatados, vanos y materia extraña 120°C/10 min minminmin Cascarilla 45-50°C/20 min minminmin Temperatura ambiente 12 • El conchado: Es esencialmente la eliminación de los sabores indeseables y la transferencia de sabor entre los ingredientes, para que el producto final resulte con las características sensoriales deseadas sabor deseado (TORRES, 2012). • Almacenamiento: Se almacena en sitios secos a 4°C /24h (DÍAZ y PINOARGOTE, 2012) 2.3. Aspectos generales de minerales Los minerales son elementos inorgánicos necesarios para la vida humana y desempeñan funciones estructurales y reguladoras dentro del organismo cumpliendo un papel importante en las funciones metabólicas, los minerales llamados también micronutrientes (vitaminas y minerales) se dividen ampliamente en minerales principales (macroelementos) y minerales de traza (microelementos) (GHARIBZAHEDI y JAFARI, 2017). 2.3.1. Los macroelementos Son los minerales que necesitamos a diario en cantidades del orden de gramos por día son el Na, K, Cl, P, Ca, Mg y S (BAKIRCIOGLU et al., 2016). • Sodio: Es un elemento químico con el símbolo Na y el número atómico 11 y tiene un peso atómico de solo 22,9898 g/M. casi todas las fuentes de alimentos contienen sodio de forma natural (HOUSECROFT y SHARPE, 2008). • Potasio: Es un elemento químico con el símbolo K y el número atómico 19 y tiene un peso atómico de solo 39,098 g/M. El potasio puede ser encontrado 13 en vegetales, frutas, patatas, carne, pan, leche y frutos secos (CACERES et al., 2006). • Fósforo: Es un elemento químico con el símbolo químico P y el número atómico 15 y tiene un peso atómico de solo 30,9738 g/M. El fósforo es el elemento número 11 en abundancia en la corteza terrestre, con un promedio de 0,01 %. Se encuentra principalmente en la materia orgánica dispersa, en los sedimentos y rocas sedimentarias (ROGER, 2011). • Calcio: Es un elemento químico con el símbolo Ca y el número atómico 20 y tiene un peso atómico de solo 40,08 g/M (EMSLEY, 2001). • Magnesio: Es un elemento químico con el símbolo Mg y el número atómico 12 y tiene un peso atómico de solo 24,3 g/M; se ha informado que las mejores fuentes de Mg dietético incluyen espinacas, legumbres, nueces, semillas y granos integrales. Además, también se encuentra que las especias, nueces, cereales, cacao y vegetales son fuentes ricas en Mg (EMSLEY, 2001). 2.3.2. Los microelementos Son sustancias inorgánicas que aparecen en el cuerpo en diminutas cantidades; en bioquímica, es un mineral dietético que se necesita en cantidades muy pequeñas para el correcto crecimiento, desarrollo y fisiología del organismo (BAILON, 2017); pero son esenciales para la salud y derivan de las cantidades que una planta necesita para su desarrollo. La mayoría de los microelementos (Cu, Fe, Mn, Mg, Se y Zn) desempeñan un papel vital como parte estructural en muchas enzimas (GHARIBZAHEDI et al., 2017). 14 • Cobre: Es un elemento químico con el símbolo Cu y el número atómico 29. Está en la parte superior del grupo 11, de la tabla periódica, por encima de la plata y el oro. Tiene un peso atómico de 63,5 g/mol (REYNOLDS, 2018). • Hierro: Es un elemento químico con el símbolo Fe y el número atómico 26 y se conoce desde el principio de los tiempos. Tiene un peso atómico de 55,8 g/mol (REYNOLDS, 2018). • Zinc: Es un elemento químico con el símbolo Zn y el número atómico 30. Es el primer elemento del grupo 12 de la tabla periódica Tiene un peso atómico de 65,4 g/mol (REYNOLDS, 2018). • Manganeso: Es un elemento químico con el símbolo Mn y el número atómico 25 y tiene un peso atómico de 54,9 g/mol (REYNOLDS, 2018). Se establece que las fuentes ricas en la dieta de Mn incluyen varios frijoles secos, guisantes, nueces, germen de trigo y granos enteros (CABRERA et al., 2009). 2.3.3. Metales pesados El término se refiere al elemento químico metálico que tenga una relativa alta densidad y sea tóxico o venenoso en concentraciones bajas, su densidad es por lo menos cinco veces mayor que la del agua. Entre estos tenemos al: aluminio (Al), bario (Ba), berilio (Be), cobalto (Co), cobre (Cu), es taño (Sn), hierro (Fe), manganeso (Mn), cadmio (Cd), mercurio (Hg), plomo (Pb), arsénico (As), cromo (Cr), molibdeno (Mo), níquel (Ni), plata (Ag), selenio (Se), talio (Tl), vanadio (Va), oro (Au) y zinc (Zn) (SHIMADA, 2005 y CONCON, 2009). En general se considera, que los metales son perjudiciales, pero muchos resultan esenciales en nuestra dieta y en algunos casos, su deficiencia o exceso 15 puede conducir a problemas de salud, por ejemplo, el organismo requiere de hierro, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, vanadio, estroncio y zinc. Otros en cambio no cumplen una función fisiológica conocida, alteran la salud y es mejor evitarlos siempre (IPCS, 2002). Aquellos que serán objeto de análisis son el plomo y el Cadmio: • Cadmio: Es un elemento divalente, con un peso atómico de 48, masa atómica de 112,41 g/mol, punto de fusión 320,9 ºC y punto de ebullición de 767 ºC. Es fácilmente soluble en ácidos minerales, con los que forma las sales correspondientes y es insoluble en agua, aunque sus sales de cloro y sulfato sí lo son. La incorporación natural de cadmio procede, principalmente, de la actividad volcánica, lixiviación de rocas e incendios forestales (NIÑO, 2015). Para la mayoría de los seres vivos la principal fuente de exposición al cadmio son los alimentos y el agua, en animales, los rangos de absorción son muy diversos, pero más bajos que en humanos (ROGERS et al., 2012). Las especies con dieta vegetal son los de mayor acumulación de cadmio, debido a que los alimentos ricos en fibra como cereales, vegetales y papas contribuyen a una mayor exposición (DICKSON, 2013). • Plomo: El plomo es un metal pesado de color grisáceo que presenta un aspecto de color brillante al corte, y que se oxida rápidamente, tiene como número atómico 82, peso atómico 207 g/mol, color azuloso, Forma muchas sales, óxidos y compuestos organometálicos (HARDMAN et al., 2011). 16 2.4. Generalidades de los compuestos bioactivos Los compuestos bioactivos alimentarios son componentes naturales que tienen actividad biológica y en algunos casos proporcionan un valor nutricional. Desempeñan un papel importante en la salud y seguridad de la comunidad debido a los roles confirmados en el crecimiento y desarrollo humano, además de reducir los riesgos de enfermedades (LAGOS et al., 2015). Durante las últimas dos décadas, la industria alimenticia ha invertido muchos esfuerzos en la investigación y el desarrollo de alimentos más saludables y más nutritivos (MADUREIRA et al., 2015). 2.4.1. Polifenoles totales Según RAMIREZ et al. (2013) nos dice que los frutos, en adición a los nutrientes esenciales y a una serie de micronutrientes tales como minerales, fibras y vitaminas, aportan además diversos metabolitos secundarios de naturaleza fenólica que se caracterizan por la presencia de uno o más anillos tipo benceno, denominados polifenoles que también se encuentran naturalmente en alimentos y bebidas de origen vegetal. Los compuestos polifenólicos, constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, estos se caracterizan por la presencia de más de un grupo de fenol por molécula, estas moléculas son importantes para la fisiología de las plantas porque contribuyen a la resistencia al ataque de microorganismos, insectos y ayudan a preservar su integridad debido a su exposición a los ambientes estresantes incluyendo radiaciones ultravioletas y temperaturas relativamente altas (GIL,2012). 17 Polifenoles en cacao: Los flavonoides son los polifenoles más abundantes en el cacao, por lo tanto, el chocolate es rico en catequina y epicatequina y sobre todo de los polímeros tipo procianidinas que se forman mediante el procesamiento del grano de cacao por unión desde 2 a 10 monómeros de epicatequina debido a la acción en esas condiciones de la enzima polifenol oxidasa. Las procianidinas formadas por la unión de 2 a 6 monómeros de epicatequina son las más abundantes, mientras las que contienen de 2 a 5 monómeros son las más activas, probablemente debido a que la forma monomérica es metabolizada rápidamente y excretada, mientras las poliméricas mayores de 6 unidades pueden tener dificultades para penetrar las membranas celulares y son por tanto pobremente absorbidas (GUTIERREZ, 2002). Son almacenados en las células pigmentarias de los cotiledones de los granos de cacao y le aportan colores que van desde el blanco hasta un morado oscuro, en la semilla de cacao los polifenoles se encuentran en la cascara y en el cotiledón, el cual se caracteriza por el color violeta intenso, color relacionado con polifenoles (ZAPATA et al., 2013). 2.4.2. Las antocianinas Las antocianinas tienen significado del griego anthos flor y kyanos azul, son el grupo más importante de pigmentos solubles al agua visible para el ojo humano, forman parte de la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenólicos. Los colores rosas, rojo, azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la presencia de estos pigmentos, se hallan en las células epidermales o subepidermales de la planta (CUEVAS et al., 2008). 18 Las antocianinas en el cacao y antocianidinas están asociadas a la formación de precursores del sabor característico del chocolate, tras formar complejos con proteínas y péptidos, y de la polimeración oxidativas con otros polifenoles durante la fermentación. Se ha establecido la relación entre la constitución de polifenoles presentes en los cotiledones y en el desarrollo del sabor al chocolate a mayor concentración de antocianinas más amargo es el producto y mayor es el tiempo de fermentación de los granos de cacao (MARQUEZ, 2009). 2.5. Capacidad antioxidante Según CADENA y HERRERA (2008), la determinación de polifenoles totales en cacao sus productos incluyen su medición por el método de Folín Ciucalteu o la cuantificación por HPLC (cromatografía Liquida de alta presión) de (-)- epicatequina y (+)-catequina, Existen métodos que se aplican los dos tipos de mecanismos como el ABTS y DPPH. Se conoce como capacidad antioxidante total o actividad antioxidante total a la medición analítica de concentraciones de radicales de diferente naturaleza, en un sistema oxidativo controlado (In vitro) (CIAPPINI y STOPPANI, 2014). Los antioxidantes son de gran interés nutricional contribuyendo al mantenimiento de salud humana protegiendo al organismo del daño producido por agentes, como los rayos ultravioletas, la polución ambiental y sustancias químicas presentes en alimentos es decir son sustancias que cuando están presentes en los alimentos retrasan, controlan e inhiben la oxidación y el deterioro de la calidad de los alimentos (OVACO y PINEDA, 2011). 19 2.5.1. Ensayo de actividad antioxidante sobre el radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) Este método fue propuesto por BLOIS, (1958) en el cual se demostró por primera vez la capacidad del radical libre DPPH para aceptar un átomo de hidrógeno (H) proveniente de una molécula de cisteína, actualmente se utiliza el método acondicionado por BRAND-WILLIAMS et al. (1995) la molécula DPPH es conocida como un radical libre estable debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres, la deslocalización del electrón también intensifica el color violeta intenso típico del radical, el cual se disuelve en metanol y adsorbe a 515 nm. Cuando la solución de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar un átomo de hidrógeno como se muestra en la Figura 2, el color violeta se desvanece sin embargo el cambio de color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de los parámetros para las propiedades antioxidantes (ALAM et al., 2012). Figura 2. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante 2,2-difenil-2-picrilhidrazilo (radical libre) Morado. 2,2-difenil-2-picrilhidrazilo (no radical) Amarillo 20 2.5.2. Ensayo de actividad antioxidante sobre el radical 2,2′- azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico) (ABTS0+) Un formato más apropiado para el ensayo consiste en la técnica de decoloración, en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reacción con los antioxidantes RE et al. (1999) la estructura antes y después de la reacción con el antioxidante (Figura 3). Figura 3. Estructura del ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante El radical ABTS0+ presenta tres máximos de absorción a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La adición de los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS0+. De esta manera el grado de decoloración como porcentaje de inhibición del radical catión ABTS0+ está determinado en función de la concentración y el tiempo (TOVAR, 2013). 2.5.3. Equivalente de trolox Los resultados del ensayo DPPH y ABTS se pueden expresar en diferentes maneras, en esta ocasión la capacidad antioxidante se expresó en equivalente de trolox (TEAC) por sus siglas en inglés “The Trolox Equivalent ABTS+ (Azul) ABTS-2 (Incoloro) 21 Antioxidant Capacity” (MILLER et al., 1993). El trolox (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromo-2-ácido carboxílico es un análogo del α-tocoferol soluble en agua. Es conocido por su alta capacidad antioxidante y por tanto es utilizado como compuesto de referencia y actividad antioxidante, es expresada como equivalentes trolox (MARTÍNEZ et al., 2011) principalmente para los métodos de DPPH y ABTS, puesto que los protocolos seguidos por los diferentes investigadores en la determinación de la actividad antioxidante varían las condiciones (proporciones de los reactivos, concentraciones y tiempos de medición) (ARTS et al., 2004). 22 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Lugar de ejecución La presente investigación se realizó en los laboratorios de Ingeniería de Alimentos, Análisis de Alimentos, Análisis de Suelos y el Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonía-CIDBAM de la Universidad Nacional Agraria de la Selva – UNAS, ubicada en el distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de Huánuco con una presión atmosférica, 701,16 mmHg. a una altitud de 660 m.s.n.m. a 09° 17’ 08” de Latitud Sur, a 75° 59’ 52” de longitud oeste, con clima tropical húmedo y con una humedad relativa media de 84 % y temperatura media anual de 24oC. En planta de la CAC. Divisoria, ubicada en el Km 4,40 de la carretera Federico Basadre, Santa Marta, caserío Mapresa en el distrito de Pablo Felipe Luyando, provincia de Leoncio prado, región Huánuco. 3.2. Muestras de granos de cacao Las mazorcas de los árboles de cacao georreferenciados, seleccionados de 10 parcelas de investigación, pertenecientes a socios de la cooperativa, fueron protegidas con bolsas biodegradables. La selección se realizó considerando la información de producción y calidad proporcionada por los agricultores y técnicos de campo, con apoyo de 2 extensionistas de la 23 Cooperativa Agraria Cafetalera la Divisoria. Ltda. Parte de las mazorcas de cacao recolectadas fueron trasladadas al laboratorio de Ingeniería de Alimentos y la otra parte fue llevada al centro de fermentación de la cooperativa con el fin de obtener granos fermentados secos. Parte de los granos fermentados secos fueron utilizados para la elaboración de la pasta de cacao. La Figura 4, representa la ubicación geográfica de las muestras de cacao, considerando los sectores: - Pumahuasi (7 muestras). - San José de Pucate (3 muestras). - Mapresa (3 muestras). - Pendencia (6 Muestras). - Huayhuantillo (3 muestras). - Frontera (9 muestras). En el Cuadro 4, se muestran los datos de las 31 muestras analizadas, considerando sector, códigos, variedad y ubicación geográfica. Las variedades evaluadas fueron Criollo, Común, CCN-51, FC2, FC3, FC4, VPA-1, ICS-95, VPA-2 y Criollo Morado. 24 Figura 4. Ubicación geográfica de los lugares donde se tomaron las muestras de cacao. 25 Cuadro 4. Datos de las 31 muestras, considerando sector, códigos, variedad y ubicación geográfica. Nº DATOS DE LAS MUESTRAS Sector Código del poblador (socio) Código de Laboratorio Variedad cacao Ubicación Geográfica 18L UTM Altura m.s.n.m. M1 Pumahuasi 3N 32F Criollo 393849 8983627 718 M2 33F Común 393845 8983625 717 M3 34F CCN-51 393849 8983625 721 M4 FC 35F Común 396335 8984847 759 M5 36F FC2 396339 8984839 760 M6 37F FC3 396334 898939 761 M7 38F FC4 396355 8984831 762 M8 San José de Pucate RA1 39F VPA-1 396440 8985907 667 M9 40F CCN-51 372155 9019528 560 M10 41F Criollo 372163 9019525 560 M11 Mapresa BSV1 42F Común 390300 8977957 652 M12 43F CCN-51 390311 8977961 656 M13 44F ICS-95 390291 8977970 655 M14 Pendencia JM1 45F Común 382849 8993879 597 M15 46F CCN-51 322840 8993881 598 M16 47F VPA-2 390841 8972868 508 M17 BP1 48F Común 384563 8992325 611 M18 49F CCN-51 384565 8992323 611 M19 50F Criollo 384553 8992319 611 M20 Huayhuantillo QR3 51F Común 404252 8975107 769 M21 52F CCN-51 404261 8975116 767 M22 53F Criollo Morado 404260 8975104 766 M23 Frontera OC1 54F Común 405156 8973461 760 M24 55F CCN-51 405134 8973457 760 M25 56F ICS-95 405141 8973468 758 M26 OC2 57F Común 405098 8973489 782 M27 58F CCN-51 405093 8973487 783 M28 59F ICS-95 405095 8973503 784 M29 CSM2 60F CCN-51 396382 8985673 755 M30 61F Común 407038 8972795 759 M31 62F ICS-95 395331 8984828 761 26 3.3. Materiales, equipos y reactivos utilizados 3.3.1. Materiales de laboratorio y/o proceso Matraces de Erlenmeyer de 10, 25, 50, 100, 250 mL; vasos de precipitación de 25, 50, 250, 500 mL; de 1, 5 y 10 mL; tubos de ensayo de 10 mL; fiolas de 10, 25, 50, 250, 1000 mL; probeta graduada de 10,100, 250, 500, 1000 mL; espátulas metálicas, tips fisherbrand (5000l, 1000l, 200l), cubetas de poliestireno, (1cm x 1cm x 4.5cm), varilla de vidrio, micro tubos (1.5 – 2 mL); papel filtro, gradilla, tubos eppendorf (2 ml); vasos de silicona (50ml), soporte gradilla de madera; mangas de polietileno de alta densidad; placas petri de vidrio, . 3.3.2. Equipos de laboratorio y/o procesos Espectrofotómetro de absorción y emisión atómica por flama (USA agilent technology) VARIAM modelo SPECTRAA, serie 55B; Espectrofotómetro modelo Genesys 6 (USA Thermo Electrón Corporation) SN 2M6G2; Balanza de determinación de humedad (Japón ADAM ) capacidad 50 g, balanza analítica modelo ESJ-210-4 (Digital precisión), capacidad 200 g y modelo Aventurer Pro AV114 (USA OHAUS) capacidad 110 g, estufa modelo ODH6-9240ª ( Hungría TOMOS Heatring Drying Oven); congelador FFV-2065FW -20°C (USA Frigidaire); refrigerador IcebeamDoorCooling (LG Corea) modelo GR-5392QLC, homogenizador modelo (USA VORTEX GENIE-2 Scientific industrias. SITM); centrífuga modelo MIKRO 22R (Inglaterra Hettich); pH- metro (Suiza Mettler Toledo Seven Easy) pH – 14, termómetro digital infrarrojo con puntero laser tipo pistola – 32 a 380 °C, succionador de pipeta, pipette pum, bel-products pequeannock, molino eléctrico (Alemania BOCSH) 220-230V, 180W, Typ:KM13; GPS (Taiwán GARMIM), conchadora de capacidad 4 Kg. Motor 110-120V,1/4 HP; tostadora de laboratorio de 2 tambores OKADA 220°C. 27 3.3.3. Reactivos y solventes Ácido clorhídrico (HCL) (Germany Merk) 36,5% de pureza; cloruro de potasio (KCL) (España Scharlau Chemie) al 99,5% de pureza; acetato de sodio (C2H3NaO2) (USA Sigma) al 99% de pureza; ácido gálico (C7H6O5) (USA Sigma) al 98,1%; Follin-Ciocalteau phenolre agent 2N, (Sigma Aldrich); carbonato de sodio (Na2CO3) (España Scharlau Chemie) al 99,5% de pureza; etanol al 96% de pureza; 1,1- Diphenyl-1-picri-hydrayl DPPH (Sigma Aldrich, USA); 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazoline- 6-ácido sulfónico) ABTS (USA Sigma Aldrich); agua destilada H2O; persulfato de potasio (K2S2O8) p.a. (USA Sigma Chemical) ; estándar de cadmio (Cd) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de Plomo (Pb), de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Cu) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Mg) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (k) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Na) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Fe) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Mn) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (zn) de 1000 ppm marca (USA CertiPUR); estándar de cobre (Mg) de 1000 ppm (USA CertiPUR); estándar de cobre (Ca) de 1000 ppm (USA CertiPUR); ácido Nítrico (HNO3) concentrado 65% (Germany Merck); Óxido de lantano (La2 O3) al 0.5 N ( USA Merck); molibdato de amonio: (NH4)6 O24 4H2O al 5% (Germany Merck); vanadato de amonio (NH4VO3) al 0.25% concentrado (Germany Merck); dihidrógeno fosfato de potasio: (KH2PO4) al 10N (Germany Merck); 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico (TROLOX) (USA Sigma). 3.3.4. Otros Cajón de fermentación, campana extractor de gases (hechiza), cuchillo de acero inoxidable. 28 3.4. Método de análisis 3.4.1. Determinación de minerales: Se realizó por el método de espectrofotometría de absorción y emisión atómica por flama, empleando el método de digestión ácida (característica: extracto – vía húmeda) (BARRUETA, 2013 y VARIAN, 1989). 3.4.2. Determinación de Fósforo (P): Por el método molibdato – vanadato de amonio, espectro UV visible thermo scientific USA (CALDERÓN Y PAVLOVA, 2004). 3.4.3. Cuantificación de polifenoles totales: se determinó espectrofotométricamente según el método de Follin-Ciocalteau (SINGLETON Y ROSSI, 1965). expresado como equivalentes de ácido gálico. 3.4.4. Cuantificación de antocianinas, se determinó por el método del pH diferencial (MARTÍNEZ et al., 2011). 3.4.5. Determinación de la Capacidad Antioxidante - Capacidad de inhibir radical 2,2-difenil-1- picrythydrazyl (DPPH): Se realizó por el método espectrofotómetro UV/Visible a 510 nm descrito por Brand-WILLIAMS et al. (1995). - Capacidad de inhibir radical libre 2,2-azinobis (3- etilbenzotiazoline – 6 ácido sulfónico) (ABTSº+): Se realizó por el método descrito por RE et al. (1999), Los resultados de la determinación de la capacidad antioxidante se expresaron en equivalente Trolox (ET) descrito por MILLER et al. (1993). 29 3.5. Metodología experimental En la Figura 5, se muestra los parámetros y procedimientos de la obtención de granos frescos secos, fermentados secos y pasta de cacao la cual se describe a continuación. - Enfundado: esta técnica nos sirvió para una cosecha sana en un 90% de todas las muestras enfundadas; es decir, una mazorca libre de plagas más comunes como: el mazorquero o carmenta, la Phytoptora, Monilia, chinche, etc, (TECNATROP, 2018). - Cosecha: Se tuvo en cuenta el índice de madurez de las mazorcas, siendo debidamente rotuladas por cada variedad de cacao en cada parcela de investigación para posteriormente ser transportadas a los centros de investigación. - Quiebre y desgrane: Para ello se utilizó un cuchillo sin filo y en seguida las semillas fueron separadas de la placenta y puestas en mallas de nylon debidamente rotuladas por cada muestra de investigación. - Fermentación: Se añadieron las muestras en los cajones de fermentación donde se encontraban las semillas de cacao cubiertas de baba o pulpa del proceso normal de la cooperativa, realizándose las remociones y controlando los días (5 días) para retirarlas del cajón (APCACAO, 2015). - Secado: Las muestras frescas fueron sometidas a 60°C por 21 horas en la estufa mientras que las muestras fermentadas fueron expuestas al sol sobre mantadas o costales hasta obtener una humedad de 7% en ambos casos, según la NTP (2006). 30 - Tostado: Los granos fueron tostados a 120 °C por 9 min, en la tostadora de doble tambor dejando enfriar a temperatura ambiente. - Descascarillado: Se realizó de forma manual separando la cascarilla de la nuez. - Molido: Se realizó de forma manual con ayuda de un pilón de madera y un bol de acero inoxidable ya que son pequeñas cantidades. - Conchado: Se sometió a temperaturas de 53 °C por 20 minutos. - Empaquetado/Envasado: En el caso de las muestras fresco secas y fermentado secas se empaquetó (400 g aproximadamente) en mangas de alta densidad y finalmente codificadas y selladas, en el caso de las muestras de pasta de cacao se utilizó envases de plástico (300 gramos aproximadamente), finalmente codificadas y serradas herméticamente. - Almacenado. En el caso de las muestras frescos secas y fermentadas secas se almacenaron en cajas de cartones a temperatura ambiente mientras que las muestras de pasta de cacao se almacenaron a 8°C (refrigeración), para posteriormente proceder a obtener los extractos y luego realizar los análisis químicos correspondientes que se muestran gráficamente en la Figura 5. 3.5.1. Preparación del extracto por digestión ácida – vía húmeda para el análisis de macroelementos, microelementos cadmio y plomo El procedimiento para la preparación de los extractos fue por digestión ácida – vía húmeda, se inició una vez obtenidas las muestras de granos de cacao frescos secos, granos fermentados secos y pasta de cacao, luego se procedió a realizar la molienda, pesando así 2 g de muestra, utilizaron matraces 31 Erlenmeyer previamente lavados con una solución (1:1) ácido nítrico con agua destilada (HNO3 – H2O d), se adicionó a cada matraz 5ml de la mezcla ácida 1:4 (4ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado al 65% y 1ml de ácido clorhídrico (HCL) concentrado al 36,5%). Luego se colocaron los matraces en las placas de Figura 5. Flujograma para la obtención de las muestras en granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao. Fermentado Grano fermentado seco 5 días Humedad: 7% 120 °C x 9 min 53° C x 20 min Bolsas biodegradables Secado 60°C X 21 Hs. hasta 7 % humedad Mazorcas con buen índice de madurez Socios de la C.A.C .la divisoria Ltda. Parcelas-árboles de cacao Enfundado de mazorcas Cosecha Quiebre y desgrane Granos frescos secos Empaquetado/envasado secado Tostado Descascarillado Molido Conchado Almacenado Pasta de cacao 32 digestión dentro de la campana del extractor de gases (la mezcla ácida digiere los componentes de la muestra como las proteínas, grasa, etc. quedando en mayor proporción los minerales, luego se cubrió cada matraz con un embudo, para dilatar el proceso de volatilización, la temperatura máxima de trabajo fue 200 °C por 60 min (a mayor temperatura, mayor volatilización de la mezcla ácida), se tomó como punto final de la digestión cuando el color del digerido fue amarillo tenue. Luego de ello se dejó enfriar a temperatura ambiente sin agitar, se añadió 1ml de peróxido de hidrogeno (H2O2 – Agua oxigenada), se esperó 30 minutos y se filtró (papel filtro) enrazando en una fiola de 25ml con agua destilada; el filtrado se envasó en tubos falcon rotulados, posteriormente se tomaron las alícuotas y se realizó el análisis correspondiente en el espectrofotómetro de absorción y emisión atómica de flama, se analizó K, Na, Ca, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn, Cd, Pb. El fósforo (P) se analizó por espectrofotometría visible, las muestras se analizaron por triplicado. 3.5.2. Determinación de cadmio (Cd), plomo (Pb), cobre (Cu), hierro (Fe) y manganeso (Mn), en los granos frescos, secos y pasta de cacao Se determinó por lectura directa del extracto (filtrado) obtenido de la digestión ácida, cuyos parámetros de calibración del equipo se encuentran indicados en el Cuadro 5, los parámetros de calibración de las concentraciones de los estándares de control y los valores de las pendientes para cada mineral (Anexo I a Anexo V). 34 Cuadro 5. Parámetros de calibración del espectrofotómetro de absorción y emisión atómica Cd, Pb, Cu, Fe, Mn. Cálculos: ppm del mineral = (ppm leídas mineral x V. de aforamiento) / (gr. de muestra) = (ppm leídas X 25 mL) / 2g de muestra Parámetros de calibración Minerales Cd Pb Cu Fe Mn 1. Longitud de onda (λ) 228,8 nm 228,8 nm 324,7 nm 248,3 nm 403, 1 nm 2. Ancho de hendidura de la celda (AH) 0,5 nm 0,5 nm 0,2 nm 0,2 nm 0,2 nm 3. Punto de trabajo óptimo (RTO) 0,02-3 µg/Ml 0,1-3 µg/mL 0,03-1 µg/Ml 0,06-1,5 µg/mL 0,02-5 µg/mL 4. Gas Acetileno Acetileno Acetileno Óxido nitroso/ Acetileno Acetileno 5. Concentración del patrón standard 1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 35 5.5.1. Determinación de fósforo (P) en los granos frescos, fermentados y pasta de cacao El procedimiento para la determinación de P en las muestras se empieza tomando una alícuota de 0,5 mL de filtrado de digestión ácida, se agregan 2 mL de agua destilada y 1 mL de la solución molibdato – vanadato de amonio, desarrollándose inmediatamente el color amarillo, se deja 5 min en reposo y para posteriormente proceder con la lectura. Para los patrones se proceden de igual manera que para las muestras, tomándose 2,5 mL de cada patrón + 1 mL de la solución de molibdato – vanadato de amonio. Sé prepararon dos soluciones como son, la solución A pesando 12,5 g de molibdato – vanadato de amonio ((NH4)6Mo7O244H2O) al 5%, se agregó 150 mL de agua destilada, se calentó suavemente hasta completar la dilución aforando a 250 mL y la solución B: vanadato de amonio (NH4VO3) al 0,25%, se pesaron 0,25g seguidamente se agregó 125 mL de agua destilada más 62,5 mL de HNO3 concentrado al 65%, se dejó enfriar para aforar a 250 mL. Finalmente, en un balón de 500 mL se disuelve la solución A sobre la solución B en una proporción 1:1 y el conjunto resultante se diluyó aforando a 1 L de agua destilada. Para la preparación de solución patrón primario de fósforo (100 ppm), Se pesó 0,439 g de dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4 ) 7 N se agregó 300 mL de agua destilada y 10 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 10 N y se aforó a L con agua destilada, el ácido Sulfúrico 10 N (H2SO4); se tomó 280.31 g H2SO4 y se aforó en 1 L de agua destilada, guardar la solución en un frasco color caramelo y bien tapado. Se construyó la curva patrón empleándose 6 36 concentraciones del estándar, tal como se detalla en el Cuadro 6 y el grafico en el Anexo VI. Cuadro 6. Parámetros para la elaboración de la curva patrón de fósforo. Luego de la preparación de soluciones se dejó reposar por 15 minutos para leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda λ = 470 nm en el espectrofotómetro UV visible. Cálculos: Constante K = Concentración %P = (K x absorbancia x V. aforamiento x Alícuota x 100) Es (10(6)*0,5g = K*abs*0,0025) 5.5.2. Determinación de los minerales sodio (Na), zinc (Zn) Se determinó por lectura del extracto (filtrado) obtenido de la digestión ácida diluida en una proporción de 1:10, (200 µL de muestra y 1800 µL de agua destilada en tubos eppendorf, los parámetros de calibración del equipo N° de tubos estándar P (mL) Agua (mL) Molibdato de Amonio (mL) Total (mL) ppm 1 (blanco) 0,0 5,0 5 10 [0] 2 0,4 4,6 5 10 [2] 3 0,8 4,2 5 10 [4] 4 1,2 3,8 5 10 [6] 5 1,6 3,4 5 10 [8] 6 2,0 3,0 5 10 [10] 37 se encuentran indicados en el Cuadro 7, los parámetros de calibración de las concentraciones de los estándares de control y los valores de las pendientes para cada mineral (Anexo VII, Anexo VIII). Cuadro 7. Parámetros de calibración del equipo para determinar Na y Zn. Parámetros de calibración Minerales Na Zn 1. Longitud de onda (λ) 589,0 nm 213,9 nm 2. Ancho de hendidura de la celda (AH) 0,5 nm 1,0 nm 3. Punto de trabajo óptimo (RTO) 0,002-1.0 µg/ml 0,01-2 µg/ml 4. Gas Acetileno Acetileno 5. Concentración del patrón standard 1000 ppm 1000 ppm 5.5.3. Determinación de calcio (Ca), magnesio (Mg), potasio (K) Se determinó por lectura del extracto (filtrado) obtenido de la digestión ácida diluida en una proporción de 1:1000 es decir, primero se hizo una dilución 1:100 (20 µL de muestra (extracto) cogidas de los tubos falcon y 1980 µL de óxido de Lantano La2O3 0,5 N en un tubo eppendorf, cogemos nuevamente 20 µL de esta dilución 1:100 y 1980 µL de óxido de lantano en un tubo eppendorf, cuyos parámetros de calibración del equipo se encuentran indicados en Cuadro 8 y los parámetros de calibración de las concentraciones de los estándares de control y los valores de las pendientes para el calcio, magnesio y potasio (Anexo IX, Anexo X, Anexo XI). 38 Cuadro 8. Parámetros de calibración del equipo para determinar Ca, Mg y K. Parámetros de calibración Minerales Mg Ca K 1. Longitud de onda (λ) 202,6 nm 213,9 nm 766,5 nm 2. Ancho de hendidura de la celda (AH) 1,0 nm 0,5 nm 1,0 nm 3. Punto de trabajo óptimo (RTO) 0,003-1 µg/ml 0,01-3 µg/ml 0,03-2,0 µg/ml 4. Gas Óxido nitroso/Acetileno Óxido nitroso/Acetileno Acetileno 5. Concentración del patrón standard 1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm La preparación del óxido de lantano (La2O3) al 0,5 N se realizó teniendo en cuenta que en 1 L se utiliza 6 g de óxido de lantano (La2O3) y 50 mL de ácido clorhídrico (HCl) concentrado al 36,5%. Entonces, en una fiola de 2000 mL se añadió 12g de La2O3 pesados en un vaso precipitado para disolver con agua destilada agitando la mezcla (varilla), una vez disuelto se adicionó 100 mL de ácido clorhídrico, con ligeros movimientos se enrasó con agua destilada 5.5.4. Preparación del extracto hidroalcohólico para los análisis de compuestos bioactívos y capacidad antioxidante de los granos frescos, secos y pasta de cacao Las muestras de granos de cacao, fueron sometidas a una extracción hidroalcohólica 50:50 (V:V), empleando 20 mL de solución hidroalcohólica por cada muestra (cada tubo falcon rotulado), se procedió a dejar 39 en agitación por 24 horas a temperatura ambiente, luego de cumplidas las 24 horas se precedió a realizar el filtrado, el extracto obtenido de la filtración se llenó en tubos eppendorf para centrifugar a una temperatura de 4°C, un tiempo de 10 minutos y a una velocidad de 10000 rpm, finalmente se guardaron 2 mL muestras en la refrigeradora dejando muestras a temperatura de congelación para utilizarlas como reservas por cualquier percance ocurrido mediante el proceso de análisis. 5.5.5. Cuantificación de polifenoles totales En el procedimiento para la cuantificación de polifenoles totales en las muestras se prepararon las siguientes soluciones: Solución de carbonato de sodio (NaCO3) al 7,5 % con agua destilada. (7,5 g enrazados a 100 mL de agua destilada) también la solución de ácido gálico 12 mM en metanol, luego de ello se determinó la dilución apropiada de la muestra para cada caso entonces se agregó 100 uL en una cubeta alcohol (OH - muestra control) y en las otras cubetas 100 uL de la muestra y/o estándar luego se agregó 500 uL de solución de fenol de folin-ciocalteau diluido (1/10), 10%. Se vorteó nuevamente y reposó 8 min a temperatura ambiente. Para neutralizar la reacción se agregó 400 uL de carbonato de sodio (NaCO3) al 7,5 %, se puso a reposo por 2 horas en un lugar oscuro a temperatura ambiente, tiempo en el que hay una completa reacción. Seguido de ello se encendió y calibró el espectrofotómetro (calentó 30 min), para el análisis. Para determinar la cantidad de compuestos fenólicos producidos durante la reacción, se preparó la solución stock de [100 mg/mL] de ácido gálico (AG) es decir 0,01g AG en 100mL de agua destilada y finalmente se realizó las lecturas de la absorbancia a 740 nm, para cada muestra con sus respectivas 40 repeticiones. Se preparó las soluciones estándares utilizando las siguientes concentraciones para la elaboración de la curva estándar especificadas en el Cuadro 9, en el anexo se aprecia las concentraciones y absorbancias (Anexo XII). Cuadro 9. Concentraciones utilizadas en la elaboración de los estándares de AG, para realizar la curva patrón de los polifenoles totales. Estándar AG (µg/mL) Vstockd (µg/mL) Vaguad. (uL) Vf (uL) S1 10 100 900 1000 S2 25 250 750 1000 S3 50 500 500 1000 S4 75 750 250 1000 S5 100 1000 0 1000 Se realizó un análisis de regresión lineal, a partir del cual se obtuvo la curva estándar con un Y = 0,0098x – 0,0313 y R² = 0,9972, cuyo gráfico se muestra en el Anexo XIII. Luego se realizaron los cálculos de polifenoles totales de la siguiente manera. Los resultados de las absorbancias obtenidas fueron sometido al análisis de regresión lineal, para lo cual se utilizó el modelo matemático y = a + bX , luego se multiplicó por el factor de dilución: FD de muestras de granos de cacao frescos secos = (1:50), FD de muestras de granos de cacao fermentados secos = (1:25), FD de muestras de pastas de cacao = (1:25), seguido a ello se dividió entre la concentración del extracto (1:20) = 50 mg/mL Es decir, 1 g de muestra 20 mL de solución Hidroalcohólica 𝑥 = 1𝑔 20𝑚𝐿 = 41 0.05𝑔 𝑚𝐿 𝑋 1𝑔 1000𝑚𝑔 = 50𝑚𝑔/𝑚𝐿 luego se multiplicó por el factor de dilución de la reacción = 10 ,es decir, 𝐶1 𝐶2 = 𝑉2 𝑉1 = 𝐹𝐷 y finalmente los resultados se expresaron en equivalente de ácido gálico (g EAG/100 g de muestra). 5.5.6. Cuantificación de antocianinas El procedimiento para la cuantificación antocianinas se inició con la preparación las soluciones buffer, primero de cloruro de potasio, buffer, 0,025 M, pH 1,0, es decir se mezcló 1,86 g de cloruro de potasio (KCl) en 980 mL de agua destilada ajustando el pH a 1,0 con HCl concentrado y se transfirió a una fiola de 1 L y se enrazó con agua destilada. Segundo se preparó la solución de acetato de sodio, buffer, 0,4 M, pH 4,5, es decir se mezcló 54,43 g de acetato de sodio (C2H3NaO2) con 970 mL de agua destilada. Se midió el pH y ajustó a 4,5 con (HCl) concentrado y luego se transfirió a una fiola de 1 L y enrazó con agua destilada. Las soluciones serán estables a temperatura ambiente durante unos meses, pero el pH debe ser medido y ajustado antes de su uso. Seguidamente Se encendió y calibró el espectrofotómetro (calentó 30 min), para las lecturas correspondientes, pero antes de ello se determinó la dilución apropiada preparando dos diluciones de las muestras que son: FD de la muestra de granos frescos secos es (1:20), es decir, 50 µL de muestra en 950 50 µL de Buffer 1 y pH 4,5 el siguiente FD de la muestra de granos fermentados secos es (1:5), es decir 200 µL de muestra en 800 µL de Buffer 1 y pH 4,5 y el último FD de la muestra pasta de cacao (1:5), es decir, 200 µL de muestra en 800 µL de Buffer 1 y pH 4.5. Finalmente, e hizo las lecturas mediante un barrido entre 510 a 700 nm, utilizar agua destilada como blanco para determinar la línea base. Se 42 calcularon las absorbancias de las diluciones de las muestras de acuerdo a la ecuación 1. Abs = (AλVis-Max – A700nm)pH1 – (AλVis-Max – A700nm)Ph4.5 (Ley de Lambert-Beer), finalmente se calculó el contenido de los pigmentos como cyanidin-3-glucocido, donde MW=449.32 y =26900.La ecuación presentada asume un espesor de celda de 1 cm (MÓNICA y RONALD, 2001), Entonces reemplazando a nuestros resultados la absorbancia (A) se calculó sí: A = (Aλmax – A700)pH=1.0 - (Aλmax – A700)pH=4.5 ; A = (510 – 700)pH = 1 – (510 – 700)pH=4.5 La concentración de antocianinas totales se obtuvo de la ecuación 2: 𝐴𝑇(𝑚𝑔/𝐿) = AxMWxFDx1000  x1 , Donde: AT: Antocianinas Totales; A: Absorbancia = lecturas; MW = PM: Peso molecular. = 449.32; FD: Factor de dilución (fresco seco 1:20, fermentado seco y pasta 1:5);  : Absortividad molar = 26900 y 1000 es el factor de conversión de gramos a miligramos, finalmente la concentración de antocianinas se expresó como mg cianidina-3-glucósido/L de extracto. 5.5.7. Determinación de capacidad antioxidante en los granos frescos, secos y pasta de cacao. - Capacidad de inhibir radical ABTS0+ (Acido 2,2′-azino-bis-3- etilbenzotiazolin-6-sulfonico) Según la metodología este radical ABTS0+ se forman después de la reacción de ABTS, el procedimiento inicia a partir de las preparaciones de las soluciones stocks teniendo en cuenta el peso molecular del ABTS0+ = 548,68g/mol: 10 mL de solución peroxodisulfato de Potasio (K2O8S2) 122,5 mM 43 y 10 mL Solución de ABTS0+ 7mM (0,038𝑔 𝑑𝑒 𝐴𝐵𝑇𝑆 ) con agua destilada desionizada más 200 uL de solución peroxodisulfato de potasio 122,5 mM. Se almacenaron en un frasco ámbar a temperatura ambiente por 16 horas, se tomó 1 mL de solución ABTS0+ y se enrazó en una fiola de 50 mL con alcohol al 100% hasta obtener una absorbancia de (0,7  0,01) a 734 nm. Los factores de dilución (FD) que se utilizaron para cada Face de muestras fueron los siguientes: FD fresco seco: 1/25; FD fermentado seco: 1/10; FD pasta: 1:15; La inhibición de los radicales ABTS0+ es determinado por la decoloración del verde a amarillo, el cual es medido por espectrofotometría a 734 nm. Para ello se hace reaccionar 10 uL de muestra con 990 uL de radical ABTS0+ por 10 minutos, en este caso el control o muestra blanco es el alcohol. Para expresar en equivalentes trolox se inició a partir la curva estándar y del porcentaje de actividad antioxidante obtenido para cada concentración. Se usó una curva de calibración (y = 0,0334x + 0,0451), en el rango de 0,25-1,5 mM de trolox / mL por 30 min los mM convertidos a µM, para la cuantificación de la actividad antioxidante, y mostró una buena linealidad (R² = 0,9978). Los resultados se expresaron como mM de trolox equivalentes (TE) Para calcular la capacidad de secuestro de los radicales ABTS0+ calculamos el porcentaje de inhibición utilizando la siguiente fórmula: ( ) % *100 control muestra t control A A Inhibición ABTS A •+ −  =     Donde: Acontrol: Absorbancia del control; Amuestra(t): Absorbancia del compuesto experimental en un tiempo “t”. Entonces se calculó la absorbancia inhibida utilizando la siguiente fórmula (AControl – AMuestra) Donde: Acontrol : Absorbancia del control; Amuestra(t): Absorbancia del compuesto experimental en 44 un tiempo (15min), seguido a ello se calculó la pendiente de la curva utilizando la siguiente formula ( 𝐶𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑜_𝑦, 𝐶𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑜𝑋) Donde: Conocido_ Y: concentraciones; conocido X : Absorbancias del compuesto experimental en el tiempo (15 min), luego se halló el intersecto de la curva y finalmennte se calculó la actividad antioxidante (µM TE/g) en las muestras utilizando la siguiente Fórmula: µM TE g = (AMuestra– Intersecto) Pendiente 𝑥 FDR x FDE x FDM x SSDPPH Donde: Amuestra(t): Absorbancias del compuesto experimental en el tiempo (15 min) Intersecto: Que se obtuvo de la regresión lineal AMuestra(t) VS [trolox], pendiente: (AMuestra(t), [trolox]) x FDR (factor de dilución de la reacción)); FDE: factor de dilución del extracto; FDM: Factor de la Muestra; SSDPPH: Solución Stock ABTS - Capacidad de inhibir radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) El procedimiento para la evaluación de capacidad antioxidante para inhibir el radical DPPH en primer lugar se prepara las siguientes soluciones stock 1 mM de DPPH teniendo en cuenta el peso molecular del mismo = 394,32g/mol, (0,0394 g de DPPH en 100 mL de alcohol al 100%), luego se vorteó la solución por 2-3 minutos hasta una completa solubilización del compuesto dejando en almacenamiento en un frasco ámbar a 4 ºC protegido de la luz. A partir de la solución stock se preparó 5 mL de solución DPPH en 50 mL de etanol 100%, como concentración final para medir la capacidad de secuestro de las muestras experimentales amarillo hasta obtener una absorbancia de 0,9+-0,01 en el espectrofotómetro UV/VIS a 510 nm. Los factores de dilución (FD) que se 45 utilizaron para cada Face de muestras fueron los siguientes: FD fresco seco: 1/20, FD fermentado seco: 1/5, FD pasta: 1:10 La inhibición de los radicales libres DPPH+º o la capacidad de eliminación de radicales libres es determinado por la decoloración de la solución de violeta a amarillo. Para ello se hizo reaccionar 25 uL de muestra más 975 uL de la solución de DPPH (1mM), A medida que hay un mayor secuestro de los radicales libres por un antioxidante, la absorbancia disminuye; en este caso muestra control o blanco es alcohol OH 96%. Se usó una curva de calibración (y = 0,9928x + 0,0427), en el rango de 0,25 – 1,5 mM de trolox / mL por 30 min los mM convertidos a µM, para la cuantificación de la actividad antioxidante y mostró una buena linealidad (R² = 0.9972). Los resultados se expresaron como mM trolox equivalentes (TE). Los análisis se realizaron por triplicado, se presentan en el Anexo XIV. Para calcular la capacidad de secuestro de radicales DPPH por un compuesto desconocido, se utilizó la siguiente expresión: %, 𝐃𝐏𝐏𝐇 𝐈𝐧𝐡𝐢𝐛𝐢𝐜𝐢ó𝐧 = [ (𝐀control − 𝐀muestra(t) 𝐀control ]𝑥100 Donde Acontrol: Absorbancia del control, Amuestra(t): Absorbancia de compuesto experimental en tiempo (15min) Y el procedimiento de los demás cálculos son los mismos que se utilizó en la capacidad de inhibir radicales libre ABTS0+. La figura 6, se muestra el diseño experimental para la determinación de minerales (macroelementos, microelementos, cadmio, plomo, compuestos bioactívos y capacidad antioxidante), en las muestras. 46 Granos frescos secos, granos fermentados secos y pasta de cacao Muestra 1 Muestra 3Muestra 2 Muestra 30 Muestra 31. . . P, k, Na, Ca, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn, Cd, Pb, Pb, polifenoles totales, antocianinas, capacidad antioxidante Figura 6. Diseño experimental para determinar contenidos de minerales, compuestos funcionales y capacidad antioxidante en las muestras. Los resultados del diseño experimental que se muestra en la Figura 6, fueron evaluados estadísticamente mediante el método multivariado, de análisis de componentes principales (ACP) (MESA et al., 2018). Cada componente principal explica una cierta cantidad de la información total contenida en los datos originales y la primera PC contiene la mayor fuente de información en el conjunto de datos. Cada componente principal subsiguiente contiene, en orden, menos información que la anterior. En la representación matricial, el modelo con un número dado de componentes tiene la siguiente ecuación: X = T P T + E Donde: T es la matriz de puntuaciones, P la matriz de cargas y E la matriz de errores. 47 La combinación de puntuaciones y cargas es la parte estructurada de los datos: la parte que es más informativa lo que queda se llama error o residual, y representa la fracción de variación que no se puede modelar bien. Al interpretar los resultados de un análisis de componentes principales (ACP), uno se enfoca en la parte de la estructura y descarta la parte residual. Está bien hacerlo, siempre que los residuos sean realmente insignificantes. Es una cuestión de cuán grande es el error que uno está dispuesto a aceptar. El análisis estadístico se realizó utilizando el software The Unscrambler® X, versión: 10.4. © 2016. CAMO Software AS (ESBENSEN y SWARBRICK, 2017). 48 V. RESULTADOS Y DISCUSIONES 5.1. Análisis general de los contenidos de minerales en las muestras La información de muestras y minerales investigados, que se presentan en los Cuadros 10 al 16 fueron utilizadas para desarrollar el modelo de componentes principales (ACP) general, el cual se utilizó para identificar la similitud entre las 31 muestras, las muestras fueron de granos frescos secos, de granos fermentados secos y de las respectivas pastas, fueron denominadas desde M1 hasta M31, estas fueron consideradas variables independientes y sus contenidos de minerales (Macroelementos: fosforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg); Microelementos: Cobre (CU), hierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn) y los metales pesados: Cadmio (Cd) y plomo 8Pb)), como variables dependientes; con el fin de establecer correlaciones entre ellos. Se debe aclarar que, si el mineral correspondía al grano fresco seco, se identificó con el número 1, si correspondía al grano fermentado seco como 2 y si correspondía a pasta de cacao, como 3; es decir en el caso del fosforo (P), tendríamos P1, P2 y P3; para cada tipo de muestra respectivamente, de igual manera se debe considerar al resto de los minerales. En el análisis de componentes principales (ACP), según (BERNARDO et al., 2018), indicaron que la principal ventaja del ACP fue transformar las variables correlacionadas en nuevos componentes no 49 correlacionados (ejes ortogonales), por lo que los datos se vuelven más fáciles de explicar. En la Figura 7, se apreció que los dos primeros componentes principales (CPs) explican el 77 % de la variancia de los datos; LI et al., (2018) indicaron que CPs con porcentajes cercanos a 100, representarán mejor a todas las variables. El gráfico para el CP1 versus CP2, claramente distinguió tres grupos de muestras, dos de ellas fueron influenciadas por el contenido de calcio; el grupo de la derecha del eje X, tuvo correlación positiva con el contenido de calcio en los granos frescos secos (Ca1), en los granos fermentados secos (Ca2) y el grupo de muestras de la izquierda del eje X, tuvo correlación negativa con el Ca1 y Ca2. El tercer grupo fue influenciado por el contenido de potasio (K1) en los granos frescos secos de cacao, influyendo positivamente en el CP2. Se pudo apreciar que la muestra M26 presento el mayor contenido de calcio en los granos frescos secos con 31,420.8 ppm y la muestra M12 el menor contenido, con 12,550 ppm. El contenido de calcio encontrado en los granos frescos de cacao, fue mayor a lo reportado por (BERTOLDI et al., 2016), quienes encontraron valores entre 1100 –1700 ppm, en granos frescos, de igual modo a lo reportado por (DJIKENG et al., 2018), quienes encontraron 2290 ppm en granos fermentados secos; esta diferencia en el contenido de calcio puede ser atribuido a diversos factores, como suelo, clima, variedad. El resto de minerales evaluados, presentaron menor influencia en la variabilidad de respuestas, por lo cual se aprecian de manera confundida en torno al cruce de los ejes que forman los CPs. 50 Se aprecio también que el mayor contenido de potasio (K1), lo tuvo la muestra M13, en el grano fresco seco, con 24,429.2 ppm y la muestra M20 presentó, el menor contenido con 12,950 ppm. Estos contenidos encontrados son similares a valores reportados por (BERTOLDI et al., 2016), entre 1,200 - 14,500 ppm en granos de cacao de diferentes orígenes del mundo y por (PEREA et al., 2011), quienes reportaron valores entre 10,000 – 13,000 ppm en granos de cacao colombianos. Figura 7. Biplot del ACP, PC1 (53%) y PC2 (24%), que explican la relación entre granos frescos secos, fermentados secos, pasta de cacao y contenido de minerales. La Figura 8, indicó que el modelo describió adecuadamente el comportamiento de las muestras, no se encontraron muestras con valores residuales elevados, que se diferencien del resto. Los valores de influencia, describieron que existen muestras con valores altos y bajos para algunos 51 componentes en comparación con el resto de las muestras. Con la información mostrada en la Figura 8, se seleccionaron las muestras que más destacaron en la variabilidad de respuestas e influyeron en los ACPs y fueron 12: M4, M5, M8, M9, M10, M12, M14, M22, M23, M25, M26 y M30 (MESA et al., 2018), obtuvieron una representación similar al hacer una investigación en un proceso de fermentación. Figura 8. Gráfico de Influencia de las muestras en el componente principal 1. En la Figura 9, se apreció que los macrominerales influyeron positivamente en la variación de respuestas, en el CP1 (97%). Se apreció también que destacaron los contenidos de calcio en las muestras de granos de cacao fermentados secos (Ca2), en granos de cacao frescos secos (Ca1), en pasta de cacao (Ca3) y el contenido de potasio en el grano fresco seco (K1). Se apreció también que los microelementos: Cobre, hierro, zinc y manganeso influyeron negativamente en la variabilidad de respuesta del CP1. De igual modo 52 se observó, que existe un grupo de muestras que presentaron un contenido similar de potasio (K3, K2), plomo (Pb1), magnesio (Mg1, Mg2, Mg3). En grupo de minerales de la izquierda, datos que forman una mancha, confundiéndose los valores obtenidos, estuvo conformado por los minerales cubre, sodio, cadmio, manganeso, hierro y zinc; los cuales se encontraban en los granos frescos, secos, granos fermentados secos y en las muestras de pasta de cacao, estos fueron los minerales que influyeron negativamente en el CP1 y presentaron los contenidos más bajos en las muestras. 5.2. Contenidos de macroelementos fosforo (P), sodio (Na), calcio (Ca) y magnesio (Mg) en las muestras En los cuadros 10 al 12, se presentan los contenidos de macroelementos en los granos frescos secos, granos fermentados secos y en la pasta de cacao. El contenido de fósforo (P) encontrado, varío entre valores de 483,24 ± 23,86 - 1,975.54 ± 13,59 ppm, correspondiente a la muestra de grano fermentado seco M15, de la variedad CCN-51 del sector de Pendencia y a la muestra de pasta de cacao de la muestra M8, VPA-1 del sector de San José de Pucate, respectivamente. Estos valores encontrados fueron inferiores a los reportados por (BERTOLDI et al., 2016), en la investigación realizada en muestras del oeste y este del África, Asia, Sud América y América Central, con valores entre 4,540 ± 38 – 5,830 ± 50 ppm; también (PEREA et al., 2011), reportaron que el P fue el mineral más abundante con contenidos entre 1000 – 1300 ppm, en muestras de cacao SCC_41, Criollo y FSA_12, en Colombia. 53 Figura 9. Biplot del ACP, PC1 (97%) y PC2 (1%), que explican la relación entre minerales en granos frescos secos, fermentados secos, pasta de cacao y muestras. 54 Cuadro 10. Contenido de macroelementos en los granos frescos secos de las muestras (n = 3). Nº Macroelementos ( ± DS, ppm) P1 K1 Na1 Ca1 Mg1 M1 820,65 ± 06,79 13,687.50 ± 25,00 125,50 ± 0,00 23,912.50 ± 12,50 5,720.83 ± 7,22 M2 942,93 ± 13,59 16,525.00 ± 12,50 165,08 ± 0,07 20,683.33 ± 50,52 5,429.17 ± 43,90 M3 811,59 ± 03,92 14,412.50 ± 54,49 280,71 ± 0,44 20,829.17 ± 38,19 5,550.00 ± 12,50 M4 1,167.12 ± 27,17 21,783.33 ± 36,08 118,71 ± 2,56 14,566.67 ± 40,18 5,658.33 ± 7,22 M5 1,427.54 ± 33,51 19,058.33 ± 38,19 129,46 ± 1,69 16,275.00 ± 0,00 5,462.50 ± 12,50 M6 1,316.58 ± 13,59 18,195.83 ± 19,09 98,75 ± 6,75 22,587.50 ± 33,07 5,525.00 ± 12,50 M7 1,241.85 ± 06,79 15,937.50 ± 37,50 126,46 ± 0,44 25,950.00 ± 25,00 6,787.50 ± 64,95 M8 1,300.72 ± 20,75 15,683.33 ± 56,37 201,71 ± 2,56 22,375.00 ± 0,00 5,512.50 ± 12,50 M9 1,022.19 ± 17,10 26,633.33 ± 7,22 161,08 ± 6,94 14,783.33 ± 36,08 5,979.17 ± 7,22 M10 967,84 ± 19,61 16,287.50 ± 25,00 173,83 ± 5,69 13,150.00 ± 12,50 5,925.00 ± 54,49 M11 963,32 ± 24,49 25,425.00 ± 33,07 355,75 ± 5,63 22,541.67 ± 26,02 5,895.83 ± 19,09 M12 831,97 ± 23,86 23,066.67 ± 50,52 344,96 ± 10,44 12,550.00 ± 12,50 6,304.17 ± 52,04 M13 897,64 ± 21,84 29,429.17 ± 36,08 154,13 ± 2,00 23,570.83 ± 31,46 5,358.33 ± 7,22 M14 841,03 ± 17,97 24,787.50 ± 37,50 237,63 ± 3,37 31,220.83 ± 7,22 7,408.33 ± 38,19 M15 757,25 ± 17,10 24,783.33 ± 38,19 179,08 ± 11,81 26,475.00 ± 45,07 6,550.00 ± 45,07 M16 1,013.13 ± 21,84 22,183.33 ± 19,09 256,38 ± 2,50 24,587.50 ± 37,50 6,545.83 ± 7,22 M17 1,278.08 ± 10,38 22,287.50 ± 25,00 201,38 ± 0,00 29,470.83 ± 7,22 6,837.50 ± 25,00 M18 831,97 ± 28,28 26,658.33 ± 31,46 151,63 ± 11,50 23,983.33 ± 7,22 5,137.50 ± 0,00 M19 684,78 ± 20,38 20,591.67 ± 36,08 216,71 ± 3,56 26,308.33 ± 7,22 7,412.50 ± 25,00 M20 895,38 ± 13,59 12,950.00 ± 0,00 195,25 ± 1,50 28,820.83 ± 38,19 5,195.83 ± 38,19 M21 834,24 ± 20,38 21,112.50 ± 0,00 129,96 ± 3,81 22,525.00 ± 12,50 7,462.50 ± 0,00 M22 1,178.44 ± 10,38 19,816.67 ± 40,18 245,83 ± 1,31 34,012.50 ± 12,50 5,412.50 ± 0,00 M23 1,017.66 ± 29,61 18,087.50 ± 33,07 128,33 ± 2,81 28,787.50 ± 12,50 5,966.67 ± 14,43 M24 693,84 ± 21,84 26,587.50 ± 0,00 139,58 ± 3,94 26,837.50 ± 33,07 5,941.67 ± 38,19 M25 759,51 ± 24,49 15,166.67 ± 40,18 140,08 ± 0,56 30,058.33 ± 28,87 6,025.00 ± 25,00 M26 1,173.91 ± 06,79 25,062.50 ± 25,00 235,04 ± 72,13 31,420.83 ± 19,09 5,375.00 ± 0,00 M27 985,96 ± 07,84 24,954.17 ± 31,46 155,25 ± 1,25 20,912.50 ± 33,07 5,458.33 ± 31,46 M28 831,97 ± 17,10 23,720.83 ± 19,09 221,50 ± 8,50 25,987.50 ± 25,00 5,295.83 ± 31,46 M29 1,235.05 ± 27,17 22,587.50 ± 33,07 354,00 ± 0,00 21,345.83 ± 43,90 5,566.67 ± 38,19 M30 1,035.78 ± 03,92 23,804.17 ± 36,08 129,75 ± 1,00 30,566.67 ± 40,18 6,941.67 ± 43,90 M31 1,223.73 ± 21,84 19,920.83 ± 31,46 73,33 ± 0,75 25,525.00 ± 0,00 7,187.50 ± 0,00 55 Cuadro 11. Contenido de macroelementos en las muestras fermentadas secas (n = 3). Nº Macroelementos ( ± DS, ppm) P1 K1 Na1 Ca1 Mg1 M1 727,81 ± 3.92 3,879.17 ± 21,95 61,75 ± 2,38 30,291.67 ± 38,19 5,087.50 ± 12,50 M2 816,12 ± 19.61 1,714.58 ± 18,04 66,08 ± 1,56 27,670.83 ± 31,46 5,033.33 ± 31,46 M3 759,51 ± 20.38 4,402.08 ± 26,02 61,21 ± 1,81 25,383.33 ± 43,90 5,220.83 ± 19,09 M4 754,98 ± 21.84 5,708.33 ± 20,09 90,21 ± 3,56 23,066.67 ± 40,18 2,708.33 ± 7,22 M5 544,38 ± 23.86 5,891.67 ± 15,73 72,63 ± 2,75 24,900.00 ± 33,07 2,758.33 ± 7,22 M6 743,66 ± 20.75 5,912.50 ± 0,00 78,50 ± 0,00 36,450.00 ± 12,50 4,712.50 ± 12.50 M7 954,26 ± 23.86 6,297.92 ± 3,61 62,38 ± 3,13 28,816.67 ± 38,19 5,037.50 ± 12.50 M8 716,49 ± 3.92 4,404.17 ± 21,95 62,50 ± 2,63 12,695.83 ± 31,46 3,125.00 ± 12.50 M9 546,65 ± 17.10 4,847.92 ± 94,65 61,71 ± 0,44 24,208.33 ± 14,43 5,475.00 ± 25.00 M10 739,13 ± 6.79 4,222.92 ± 21,95 58,75 ± 0,37 22,020.83 ± 19,09 5,170.83 ± 31,46 M11 961,05 ± 10.38 3,516.67 ± 3,61 53,00 ± 0,37 34,900.00 ± 0,00 5,162.50 ± 25,00 M12 662,14 ± 23.86 4,716.67 ± 28,18 49,71 ± 0,31 23,087.50 ± 33,07 5,070.83 ± 19,09 M13 621,38 ± 3.92 4,483.33 ± 18,04 66,46 ± 0,81 27,875.00 ± 12,50 5,295.83 ± 31,46 M14 696,11 ± 23.86 4,397.92 ± 3,61 55,25 ± 0,88 31,800.00 ± 25,00 5,675.00 ± 25,00 M15 483,24 ± 23.86 2,722.92 ± 26,02 62,83 ± 0,07 29,420.83 ± 19,09 5,070.83 ± 19,09 M16 831,97 ± 10.38 5,156.25 ± 16,54 60,96 ± 0,81 31,679.17 ± 50,52 5,375.00 ± 25,00 M17 820,65 ± 20.38 4,943.75 ± 6,25 114,13 ± 0,12 27,929.17 ± 19,09 5,083.33 ± 7,22 M18 750,45 ± 17.10 7,483.33 ± 18,04 50,13 ± 1,38 24,050.00 ± 33,07 4,987.50 ± 0,00 M19 689,31 ± 30.63 4,397.92 ± 9,55 64,63 ± 1,25 31,562.50 ± 12,50 5,100.00 ± 12,50 M20 893,12 ± 30.63 5,000.00 ± 0,00 44,96 ± 1,69 29,933.33 ± 43,90 3,712.50 ± 0,00 M21 759,51 ± 6.79 4,035.42 ± 15,73 59,75 ± 2,00 30,108.33 ± 7,22 2,783.33 ± 7,22 M22 1,151.27 ± 20.75 8,154.17 ± 15,73 58,75 ± 0,13 34,712.50 ± 12,50 5,383.33 ± 7,22 M23 908,97 ± 17.97 7,387.50 ± 0,00 68,58 ± 4,69 40,587.50 ± 0,00 5,137.50 ± 0,00 M24 761,78 ± 23.86 4,284.38 ± 9,38 54,50 ± 0,13 27,483.33 ± 7,22 5,025.00 ± 0,00 M25 893,12 ± 19.61 6,718.75 ± 18,75 53,83 ± 1,81 30,425.00 ± 12,50 4,920.83 ± 7,22 M26 782,16 ± 3.92 8,893.75 ± 12,50 50,46 ± 0,19 33,795.83 ± 38,19 5,312.50 ± 12,50 M27 759,51 ± 20.38 3,893.75 ± 12,50 72,88 ± 1,88 31,454.17 ± 38,19 5,037.50 ± 33,07 M28 976,90 ± 17.97 7,227.08 ± 19,09 48,96 ± 0,56 26,162.50 ± 0,00 4,945.83 ± 7,22 M29 904,44 ± 20.75 6,422.92 ± 9,55 42,08 ± 0,19 25,662.50 ± 25,00 5,075.00 ± 0,00 M30 707,43 ± 3.92 4,966.67 ± 28,18 51,00 ± 0,00 31,012.50 ± 37,50 4,908.33 ± 7,22 M31 816,12 ± 28.28 5,139.58 ± 9,55 49,46 ± 0,19 32,858.33 ± 7,22 5,020.83 ± 19,09 56 Cuadro 12. Contenido de macroelementos en las muestras de pasta de cacao (n = 3). Nº Macroelementos ( ± DS, ppm) P1 K1 Na1 Ca1 Mg1 M1 1,364.13 ± 35,30 8,335.42 ± 29,54 92,71 ± 2,19 20,058.33 ± 43,90 3,208.33 ± 14,43 M2 1,495.47 ± 33,51 8,581.25 ± 27,24 120,50 ± 7,62 17,350.00 ± 12,50 3,012.50 ± 0,00 M3 1,038.04 ± 6,79 7,535.42 ± 3,61 84,50 ± 0,00 21,179.17 ± 40,18 3,079.17 ± 28,87 M4 897.64 ± 20,75 9,831.25 ± 27,24 111,46 ± 6,19 16,887.50 ± 33,07 2,437.50 ± 21,65 M5 875.00 ± 6,79 6,831.25 ± 22,53 84,08 ± 0,94 17,770.83 ± 7,22 2,658.33 ± 28,87 M6 1,635.87 ± 17,97 9,593.75 ± 22,53 77,63 ± 0,00 16,320.83 ± 31,46 2,720.83 ± 7,22 M7 1,364.13 ± 6,79 6,529.17 ± 9,55 82,33 ± 0,94 18,304.17 ± 38,19 2,450.00 ± 0,00 M8 1,975.54 ± 13,59 8,966.67 ± 21,95 65,83 ± 0,69 16,804.17 ± 40,18 2,908.33 ± 7,22 M9 820.65 ± 13,59 7,281.25 ± 25,00 85,38 ± 4,13 16,787.50 ± 0,00 3,058.33 ± 14,43 M10 1,033.51 ± 23,86 6,981.25 ± 6,25 73,00 ± 2,00 16,487.50 ± 0,00 2,762.50 ± 0,00 M11 1,438.86 ± 20,38 6,525.00 ± 22,53 105,88 ± 1,50 19,283.33 ± 19,09 3,158.33 ± 36,08 M12 1,038.04 ± 13,59 5,766.67 ± 23,66 73,96 ± 2,81 13,316.67 ± 28,87 2,316.67 ± 14,43 M13 1,343.75 ± 6,79 6,883.33 ± 9,55 84,00 ± 0,38 16,458.33 ± 7,22 2,612.50 ± 21,65 M14 963.32 ± 17,97 5,075.00 ± 0,00 102,08 ± 2,81 16,908.33 ± 19,09 2,437.50 ± 21,65 M15 1,293.93 ± 10,38 7,168.75 ± 6,25 77,63 ± 0,38 14,800.00 ± 25,00 3,133.33 ± 28,87 M16 1,359.60 ± 23,86 5,887.50 ± 6,25 114,21 ± 1,69 18,537.50 ± 0,00 2,604.17 ± 14,43 M17 1,427.54 ± 23,86 9,918.75 ± 0,00 124,75 ± 0,00 20,537.50 ± 54,49 2,995.83 ± 7,22 M18 1,024.46 ± 24,49 7,493.75 ± 0,00 114,21 ± 1,69 17,350.00 ± 0,00 2,866.67 ± 14,43 M19 1,092.39 ± 20,38 6,081.25 ± 16,54 82,63 ± 3,57 19,458.33 ± 19,09 2,720.83 ± 28,87 M20 1,432.07 ± 20,38 6,912.50 ± 16,54 57,08 ± 0,44 17,325.00 ± 25,00 2,920.83 ± 14,43 M21 1,033.51 ± 10,38 4,841.67 ± 15,73 68,75 ± 2,38 22,579.17 ± 19,09 2,654.17 ± 14,43 M22 1,699.28 ± 21,84 11,018.75 ± 18,75 71,46 ± 1,31 21,566.67 ± 40,18 2,354.17 ± 7,22 M23 1,708.33 ± 17,10 8,043.75 ± 12,50 75,71 ± 0,31 22,900.00 ± 25,00 2,529.17 ± 50,52 M24 1,368.66 ± 3,92 5,779.17 ± 15,73 71,25 ± 4,00 17,970.83 ± 19,09 2,812.50 ± 0,00 M25 1,180.71 ± 6,79 5,831.25 ± 22,53 59,33 ± 0,94 15,312.50 ± 25,00 2,575.00 ± 21,65 M26 1,176.18 ± 20,75 8,839.58 ± 26,02 64,21 ± 0,81 16,400.00 ± 76,03 2,566.67 ± 14 ,43 M27 1,158.06 ± 20,75 9,020.83 ± 21,95 81,58 ± 2,44 18,812.50 ± 25,00 2,583.33 ± 28,87 M28 1,642.66 ± 27,17 7,447.92 ± 9,55 73,13 ± 5,50 17,033.33 ± 31,46 2,612.50 ± 0,0 M29 822.92 ± 20,75 7,668.75 ± 6,25 80,25 ± 0,00 17,937.50 ± 37,50 2,779.17 ± 36,08 M30 1,289.40 ± 20,38 9,537.50 ± 12,50 60,63 ± 1,25 17,770.83 ± 19,09 2,816.67 ± 14,43 M31 1,708.33 ± 10,38 7,968.75 ± 18,75 95,79 ± 4,07 16,291.67 ± 31,46 2,637.50 ± 43,30 57 El contenido de K determinado, varío entre 1,714.58 ± 18,04 - 29,429.17 ± 36,08 ppm, para la muestra M2 de grano fermentado seco, de la variedad Común del sector de Pumahuasi y para la muestra M13 de grano fresco seco, variedad ICS-95 del sector de Mapresa, respectivamente. Los contenidos de K encontrados fueron diferentes al reportado por (BERTOLDI et al., 2016) en la investigación realizada en muestras de granos de cacao de diversas partes del mundo, con valores entre 12,000 ± 80 – 14,500 ± 60 ppm, de igual modo (BAKIRCIOGLU et al., 2016), en otra investigación encontraron en muestras de leche en polvo un valor de 12,600 ± 40 ppm, éste contenido se encuentra dentro del rango determinado en las muestras de cacao. El contenido de Na, en las muestras de granos y pasta de cacao varío entre 42,08 ± 0,19 – 355,75 ± 5,63 ppm, para las muestras de grano fermentado seco M29, de la variedad CCN-51 del sector de Frontera y de grano fresco seco M11, de la variedad Común del sector de Mapresa, respectivamente. Estos valores fueron similares a los reportados por (BILANDZIC et al., 2015), para muestras de leche, mantequilla, queso fresco, con contenidos de 600 ± 13, 110 ± 26 y 430 ± 210 ppm, respectivamente. El contenido de Mg, encontrado en las muestras varió entre 7,462.50 ± 0,00 - 2,316.67 ± 14,43 ppm, para la muestra de grano fresco seco M21, de la variedad CCN-51 del sector Huayhuantillo y de pasta de cacao M12, de la variedad CCN-51 del sector de Mapresa, respectivamente. El Mg es el cuarto mineral más abundante y es necesario en más de 300 reacciones en el cuerpo, tiene función de cofactor en más de 300 sistemas enzimáticos, regulando diversas reacciones bioquímicas en el cuerpo, incluida la síntesis de proteínas, 58 funcionamiento de los músculos y nervios, además de diversas otras funciones. Según (FARTUSIE Y MOHSSAN, 2017), el Mg es uno de los diez minerales esenciales con una dosis diaria recomendada de 400 mg / día para hombres adultos sanos y 320 mg / día para mujeres adultas sanas; según los resultados obtenidos, 100 gramos de las muestras estudiadas estarían cubriendo la ingesta de Mg requerida. Al respecto (AFOAKWA et al., 2011), han reportado que el grano fermentado y sin fermentar presento 2,868±31,9 y 3,642±18,2 ppm, en cacao de Ghana. La información de macrominerales investigados, en las 12 muestras seleccionadas y que se presentan incluidas en los resultados de los Cuadros 9 al 11, fueron utilizados para desarrollar el modelo de componentes principales (ACP) para los macrominerales (Figura 10), el cual se utilizó para identificar la similitud en el contenido de minerales de las muestras, estableciéndose las correlaciones entre ellas. En la Figura 10, se apreció claramente que el calcio se encuentra en mayor proporción en todas las muestras (Ca1, Ca2, Ca3), de igual modo el potasio (K1). Se apreció también que los minerales sodio (Na1, Na2, Na3), fosforo (P1, P2, P3) y sodio (Na1. Na2, Na3), se encontraron en menor proporción en las muestras seleccionadas. De igual modo se apreció que los contenidos de potasio (K2, K3), magnesio (Mg1, Mg2, Mg3), se encontraron en cantidades similares e intermedias, en las muestras estudiadas. 59 Figura 10. Biplot del ACP, PC1 (96%) y PC2 (2%), que explican la relación entre macroelementos en granos frescos secos, fermentados secos, pasta de cacao y las 12 muestras seleccionadas. 60 5.3. Contenidos de microelementos cobre (Cu), hierro (Fe), zinc (zn), manganeso (Mn) en las muestras En los Cuadros 13 al 15, se presentan los resultados de los contenidos de microelementos en los granos frescos secos, granos fermentados secos y en la pasta de cacao. Al respecto se ha indicado que las características de los orígenes geográficos de los granos de cacao fermentados podrían vincularse tanto con el procedimiento de fermentación y secado como con las variedades de cacao, dando una gama de valores económicos al producto, por lo tanto, una necesidad de métodos adecuados de trazabilidad (DIOMANDE et al., 2015). El contenido de cobre Cu, encontrado en las muestras varió entre 29,02 ± 0,01 – 4,07 ± 0,05 ppm, para la muestra de grano fresco seco M4, de la variedad Común del sector de Pumahuasi y de pasta de cacao M3, de la variedad CCN-51 del sector Pumahuasi, respectivamente. El Cu es un oligoelemento esencial en plantas y animales. El cuerpo humano solo contiene unos 150 mg de este mineral vital. La dosis diaria recomendada de Cu en adultos sanos normales es de 2 mg / día (FARTUSIE y MOHSSAN, 2017). Es necesario para el crecimiento y la formación de hueso, la formación de vainas de mielina en los sistemas nerviosos, ayuda en la incorporación de Fe en la hemoglobina, ayuda en la absorción de Fe del tracto gastrointestinal y en la transferencia de Fe de los tejidos al plasma (STUDZINSKI et al., 2006). Los resultados del contenido de cubre encontrado en las muestras, indican que estos derivados son buenas fuentes de cobre. 61 Cuadro 13. Contenido de Microelementos en los granos frescos secos. Nº Microelementos ( ± DS, ppm, n = 3) Cu1 Fe1 Zn1 Mn1 M1 17,22 ± 0,47 37,95 ± 0,03 86,58 ± 0,07 16,83 ± 0,09 M2 15,46 ± 0,01 32,30 ± 0,02 84,42 ± 0,44 19,58 ± 0,04 M3 20,48 ± 0,00 31,68 ± 0,00 78,38 ± 0,25 15,04 ± 0,03 M4 29,02 ± 0,01 31,41 ± 0,05 54,21 ± 0,38 11,93 ± 0,04 M5 20,36 ± 0,07 28,57 ± 0,02 60,50 ± 0,00 11,86 ± 0,01 M6 18,56 ± 0,12 28,18 ± 0,05 61,83 ± 0,44 12,69 ± 0,00 M7 23,38 ± 0,24 33,16 ± 0,06 62,33 ± 0,47 9,76 ± 0,01 M8 19,82 ± 0,38 30,68 ± 0,02 55,83 ± 0,19 7,93 ± 0,06 M9 20,47 ± 0,53 28,18 ± 0,04 70,54 ± 0,38 6,36 ± 0,08 M10 13,36 ± 0,24 27,33 ± 0,03 63,92 ± 0,19 5,23 ± 0,04 M11 13,22 ± 0,09 30,47 ± 0,02 68,00 ± 0,33 4,20 ± 0,11 M12 22,53 ± 0,06 31,31 ± 0,04 63,08 ± 0,44 10,32 ± 0,13 M13 20,50 ± 0,01 22,80 ± 0,04 46,71 ± 0,14 13,33 ± 0,68 M14 16,46 ± 0,04 25,58 ± 0,01 36,92 ± 0,62 13,66 ± 0,06 M15 19,46 ± 0,08 32,94 ± 0,04 30,75 ± 0,38 33,04 ± 0,10 M16 14,46 ± 0,01 28,43 ± 0,04 32,00 ± 0,33 20,41 ± 0,27 M17 15,40 ± 0,09 30,26 ± 0,01 30,71 ± 0,38 25,50 ± 0,04 M18 17,03 ± 0,19 27,92 ± 0,02 33,50 ± 0,00 31,41 ± 0,87 M19 14,19 ± 0,18 33,40 ± 0,02 41,63 ± 0,54 20,67 ± 0,07 M20 14,79 ± 0,18 36,71 ± 0,00 67,13 ± 0,25 21,58 ± 0,03 M21 19,98 ± 0,48 27,33 ± 0,04 48,13 ± 0,45 19,68 ± 0,06 M22 19,98 ± 0,48 36,30 ± 0,05 83,25 ± 0,13 19,22 ± 0,31 M23 20,13 ± 0,01 32,79 ± 0,03 70,71 ± 0,31 21,61 ± 0,05 M24 20,66 ± 0,09 34,07 ± 0,04 65,54 ± 0,36 24,16 ± 0,37 M25 15,58 ± 0,02 27,92 ± 0,03 41,96 ± 0,44 14,16 ± 0,62 M26 24,38 ± 0,05 21,93 ± 0,22 54,08 ± 0,31 22,09 ± 0,79 M27 17,87 ± 0,17 24,05 ± 0,04 69,42 ± 0,51 14,34 ± 0,28 M28 21,95 ± 0,17 35,06 ± 0,04 69,63 ± 0,25 30,78 ± 0,21 M29 20,00 ± 0,44 36,80 ± 0,03 74,88 ± 0,50 24,04 ± 0,11 M30 18,40 ± 0,11 36,94 ± 0,04 90,46 ± 0,19 30,21 ± 0,39 M31 25,96 ± 0,35 40,51 ± 0,01 68,00 ± 0,00 26,89 ± 0,32 62 Cuadro 14. Contenido de Microelementos en los granos fermentados secos. Nº Microelementos ( ± DS, ppm, n = 3) Cu1 Fe1 Zn1 Mn1 M1 15,45 ± 0,03 15,94 ± 0,04 40,58 ± 0,44 12,68 ± 0,04 M2 13,88 ± 0,03 17,93 ± 0,01 56,79 ± 0,52 12,73 ± 0,04 M3 16,98 ± 0,13 14,46 ± 0,01 58,42 ± 0,36 14,22 ± 0,49 M4 13,15 ± 0,07 29,55 ± 0,05 47,04 ± 0,36 10,11 ± 0,01 M5 12,23 ± 0,08 29,68 ± 0,03 40,13 ± 0,00 10,94 ± 0,11 M6 10,11 ± 0,14 26,42 ± 0,04 49,29 ± 0,52 10,97 ± 0,04 M7 14,03 ± 0,05 18,05 ± 0,03 36,58 ± 0,19 5,94 ± 0,06 M8 12,65 ± 0,09 16,05 ± 0,03 45,50 ± 0,25 4,38 ± 0,04 M9 11,85 ± 0,16 20,66 ± 0,03 38,21 ± 0,31 4,48 ± 0,04 M10 10,91 ± 0,38 24,17 ± 0,06 47,71 ± 0,07 4,81 ± 0,04 M11 12,45 ± 0,03 15,32 ± 0,05 55,08 ± 0,07 3,78 ± 0,00 M12 20,81 ± 0,03 29,32 ± 0,04 36,54 ± 0,40 7,46 ± 0,01 M13 14,42 ± 0,02 29,31 ± 0,02 46,58 ± 0,36 13,38 ± 0,04 M14 15,70 ± 0,46 29,58 ± 0,04 39,29 ± 0,52 11,41 ± 0,01 M15 14,16 ± 0,02 25,70 ± 0,04 27,83 ± 0,07 20,67 ± 0,02 M16 10,42 ± 0,02 26,89 ± 0,00 56,88 ± 0,50 19,79 ± 0,01 M17 10,90 ± 0,19 28,57 ± 0,06 37,88 ± 0,38 19,06 ± 0,07 M18 13,86 ± 0,34 20,15 ± 0,03 20,75 ± 0,25 12,23 ± 0,20 M19 12,65 ± 0,06 15,82 ± 0,05 51,79 ± 0,38 18,06 ± 0,04 M20 13,32 ± 0,26 15,43 ± 0,02 44,33 ± 0,14 13,93 ± 0,21 M21 15,55 ± 0,33 22,15 ± 0,01 38,00 ± 0,38 12,87 ± 0,19 M22 11,37 ± 0,14 20,95 ± 0,04 49,38 ± 0,38 17,89 ± 0,03 M23 12,06 ± 0,04 20,78 ± 0,01 45,46 ± 0,07 18,18 ± 0,33 M24 12,50 ± 0,73 18,17 ± 0,04 45,38 ± 0,12 22,4 ± 0,11 M25 11,71 ± 0,23 31,43 ± 0,04 56,83 ± 0,44 13,81 ± 0,03 M26 11,93 ± 0,25 28,43 ± 0,05 42,92 ± 0,36 15,32 ± 0,01 M27 11,93 ± 0,20 26,20 ± 0,04 45,58 ± 0,31 13,42 ± 0,06 M28 11,66 ± 0,27 27,91 ± 0,05 51,75 ± 0,00 21,35 ± 0,00 M29 11,78 ± 0,38 25,43 ± 0,05 65,58 ± 0,56 23,42 ± 0,03 M30 11,73 ± 0,16 29,08 ± 0,03 48,17 ± 0,36 20,13 ± 0,03 M31 11,46 ± 0,09 35,04 ± 0,00 57,92 ± 0,40 16,21 ± 0,13 63 Cuadro 15. Contenido de Microelementos en las muestras de pasta de cacao. Nº Microelementos ( ± DS, ppm, n = 3) Cu1 Fe1 Zn1 Mn1 M1 6,46 ± 0.06 41,43 ± 0,02 53,13 ± 0,33 16,83 ± 0,15 M2 6,79 ± 0.01 27,53 ± 0,03 58,13 ± 0,50 14,01 ± 0,02 M3 4,07 ± 0.05 43,43 ± 0,01 70,46 ± 0,38 10,48 ± 0,30 M4 4,17 ± 0.01 43,56 ± 0,02 59,21 ± 0,36 13,98 ± 0,04 M5 5,34 ± 0.07 40,41 ± 0,01 53,25 ± 0,25 14,64 ± 0,13 M6 6,49 ± 0.09 42,41 ± 0,07 48,33 ± 0,19 16,22 ± 0,04 M7 6,80 ± 0.11 41,69 ± 0,04 53,38 ± 0,00 9,00 ± 0,05 M8 6,53 ± 0.14 39,07 ± 0,04 57,96 ± 0,07 7,38 ± 0,02 M9 4,72 ± 0.20 39,33 ± 0,02 44,25 ± 0,25 12,37 ± 0,01 M10 4,34 ± 0.01 43,32 ± 0,04 57,71 ± 0,07 12,38 ± 0,00 M11 5,06 ± 0.00 43,68 ± 0,03 63,08 ± 0,38 10,06 ± 0,03 M12 4,29 ± 0.00 35,33 ± 0,03 55,63 ± 0,38 9,19 ± 0,05 M13 4,10 ± 0.01 43,48 ± 0,00 59,58 ± 0,31 16,03 ± 0,06 M14 5,09 ± 0.09 41,80 ± 0,04 46,63 ± 0,33 18,13 ± 0,04 M15 5,10 ± 0.10 41,91 ± 0,00 28,29 ± 0,38 21,29 ± 0,02 M16 5,09 ± 0.09 40,69 ± 0,02 58,00 ± 0,00 21,10 ± 0,01 M17 5,09 ± 0.09 30,53 ± 0,03 47,96 ± 0,19 27,87 ± 0,16 M18 5,09 ± 0.09 32,58 ± 0,02 58,21 ± 0,07 22,20 ± 0,03 M19 5,33 ± 0.10 35,80 ± 0,05 65,54 ± 0,29 19,93 ± 0,03 M20 5,10 ± 0.12 30,68 ± 0,01 54,33 ± 0,31 24,92 ± 0,17 M21 5,41 ± 0.00 36,18 ± 0,05 46,92 ± 0,44 20,48 ± 0,41 M22 5,41 ± 0.00 35,44 ± 0,01 52,13 ± 0,33 21,73 ± 0,23 M23 5,41 ± 0.00 37,32 ± 0.02 49,21 ± 0,31 31,63 ± 0,13 M24 5,39 ± 0.01 38,29 ± 0.03 58,13 ± 0,33 25,78 ± 0,27 M25 5,40 ± 0.00 28,18 ± 0.05 65,42 ± 0,36 15,13 ± 0,02 M26 5,04 ± 0.00 28,54 ± 0.03 61,67 ± 0,52 31,68 ± 0,01 M27 5,39 ± 0.00 36,81 ± 0.04 85,71 ± 0,19 32,53 ± 0,48 M28 5,40 ± 0.00 33,20 ± 0.04 76,58 ± 0,14 23,96 ± 0,55 M29 5,10 ± 0.11 27,81 ± 0.04 82,88 ± 0,38 24,85 ± 0,06 M30 5,40 ± 0.00 34,18 ± 0.04 64,21 ± 0,44 31,52 ± 0,01 M31 5,31 ± 0.09 34,06 ± 0.00 75,46 ± 0,31 24,60 ± 0,20 64 El contenido de Fe, encontrado en las muestras varió entre 40,51 ± 0,01 – 14,46 ± 0,01 ppm, el mayor contenido lo presentó la muestra de grano fresco seco M31, de la variedad ICS-95 del sector de Frontera y el menor el grano fermentado seco M3, de la variedad CCN-51 del sector Pumahuasi, respectivamente. Se sabe que la dosis diaria recomendada de Fe en adultos sanos normales es de 8 mg / día para hombres y mujeres posmenopáusicas y 18 mg / día para mujeres que menstrúan (FARTUSIE y MOHSSAN, 2017), los resultados encontrados de Fe, estarían cubriendo fácilmente estos requerimientos. También se ha reportado contenidos 183 – 65,5 ppm en granos de cacao y derivados (BERTOLDI et al., 2016). El contenido de Zn, encontrado en las muestras vario entre 90,46 ± 0,19 – 20,75 ± 0,25 ppm, el mayor contenido lo presentó la muestra de grano fresco seco M30, variedad Común del sector de Frontera y el menor el grano fermentado seco M18, de la variedad CCN-51 del sector de Pendencia, respectivamente. La cantidad diaria recomendada (RDA) establecida para Zn es 8 mg / día para mujeres y 11 mg / día para hombres, apreciándose que las muestras presentaron una cantidad suficiente para cubrir este requerimiento. Se ha reportado que el Zn se encontró entre 39,4 – 73,4 ppm en muestras de granos de cacao y derivados (BERTOLDI et al., 2016), rango similar al encontrado en las muestras evaluadas. El contenido de manganeso (Mn) vario entre 33,04 ± 0,10 – 3,78 ppm, el mayor contenido lo presento el grano fresco seco, muestra M15, variedad CCN-51 del sector de Pendencia y el menor contenido lo presentó el grano fermentado seco, muestra M11, variedad Común del sector de Mapresa, 65 respectivamente. Mn ayuda al cuerpo a formar tejido conectivo, huesos, factores de coagulación de la sangre y hormonas sexuales. También desempeña un papel en el metabolismo de las grasas y los carbohidratos, la absorción de calcio y la regulación del azúcar en la sangre. Mn también es necesario para la función normal del cerebro y los nervios. Además, el Mn es un componente clave de los sistemas enzimáticos, incluidas las enzimas que manejan oxígeno. Es un componente que ayuda a combatir los radicales libres. La dosis diaria recomendada de Mn es de 2,3 mg / día para los varones adultos y 1,8 mg / día para las mujeres adultas (FARTUSIE y MOHSSAN, 2017). Los valores encontrados en las muestras estudiadas satisfacen adecuadamente estos requerimientos. También se reportó un contenido de Mn para granos de cacao y derivados entre 24,1 – 35,4 (BERTOLDI et al., 2016), valores similares a los encontrados. La información de microelementos investigados, en las 12 muestras seleccionadas y que se presentan incluidas en los resultados de los Cuadros 12 al 14, fueron utilizados para desarrollar el modelo de componentes principales (ACP) para estos elementos (Figura 11), el cual se utilizó para identificar la similitud en el contenido de minerales de las muestras, estableciéndose las correlaciones entre ellas. La Figura 11, explica el ACP (96%), del contenido de microelementos y su correlación con las muestras; se puede apreciar claramente que el mayor contenido lo tiene el Zn1 en las muestras frescas secas M30, M22, 66 M23 y M9 y el menor en las muestras M25, M14 y M4; también se aprecia que el contenido de Manganeso (Mn3) es mayor en las muestras de pasta de cacao y en las mismas muestras indicadas, luego disminuyo para muestras frescas secas y muestras fermentadas secas. La presencia de cobre en las muestras fermentadas secas y en pasta de cacao fueron ligeramente diferentes. La figura indica también que el hierro estaba presente en menor cantidad en la muestra M25, luego aumentó en las muestras M14, M4, M8 y M10. Figura 11. Biplot del ACP, PC1 (92%) y PC2 (4%), que explican la relación entre microelementos cubre (Cu), hierro (Fe), zinc (Zn) y manganeso (Mn) en las 12 muestras seleccionadas. 67 5.4. Contenidos de cadmio (Cd) y plomo (Pb) en las muestras En el Cuadro 16, se muestra el contenido de Metales Pesados en las muestras de granos frescos secos, fermentados secos y pasta de cacao. En forma general, considerando todas las muestras, el menor contenido de cadmio (Cd) fue encontrado en la muestra de pasta de cacao M27, de la variedad CCN- 51 del sector de Frontera con 0.05 ppm y el mayor contenido en la muestra de grano fresco seco M17, de la variedad Común del sector de Pendencia con 1,20 ± 0,02 ppm. El menor contenido de plomo (Pb) lo presentó la muestra de pasta de cacao M15, variedad CCN-51 del sector de Pendencia con 0,20 ± 0,02 ppm y el mayor contenido lo presento la muestra de grano fresco seco M15, de variedad CCN-51 del sector de Pendencia con 4,66 ± 0,01 ppm. 68 Cuadro 16. Metales Pesados en los granos frescos secos, fermentados secos y pasta de cacao ( ± DS, ppm, n = 3). Nº Granos frescos secos Granos fermentados secos Pasta de cacao Cd1 Pb1 Cd2 Pb2 Cd3 Pb3 M1 0,93 ± 0,01 1,28 ± 0,01 0,18 ± 0,01 1,96 ± 0,03 0,10 ± 0,00 0,38 ± 0,01 M2 0,91 ± 0,03 2,54 ± 0,03 0,16 ± 0,02 2,53 ± 0,01 0,08 ± 0,00 0,78 ± 0,03 M3 0,66 ± 0,02 3,96 ± 0,00 0,20 ± 0,01 2,56 ± 0,04 0,08 ± 0,01 1,84 ± 0,01 M4 0,11 ± 0,00 4,48 ± 0,00 0,08 ± 0,00 2,08 ± 0,04 0,05 ± 0,00 2,27 ± 0,01 M5 0,09 ± 0,00 4,39 ± 0,00 0,09 ± 0,00 2,48 ± 0,01 0,08 ± 0,00 1,42 ± 0,02 M6 0,08 ± 0,01 2,93 ± 0,02 0,11 ± 0,00 2,81 ± 0,05 0,06 ± 0,00 1,35 ± 0,02 M7 0,05 ± 0,01 3,19 ± 0,04 0,06 ± 0,01 2,40 ± 0,02 0,06 ± 0,01 2,01 ± 0,01 M8 0,33 ± 0,01 3,91 ± 0,01 0,15 ± 0,00 2,57 ± 0,02 0,14 ± 0,00 0,66 ± 0,01 M9 0,34 ± 0,00 3,20 ± 0,04 0,14 ± 0,00 2,45 ± 0,00 0,13 ± 0,01 0,90 ± 0,01 M10 0,61 ± 0,01 2,57 ± 0,05 0,16 ± 0,00 2,70 ± 0,01 0,15 ± 0,00 1,58 ± 0,02 M11 0,61 ± 0,01 2,55 ± 0,03 0,11 ± 0,00 2,83 ± 0,02 0,08 ± 0,01 0,82 ± 0,01 M12 0,15 ± 0,00 3,05 ± 0,03 0,15 ± 0,01 3,16 ± 0,05 0,09 ± 0,03 0,44 ± 0,01 M13 0,22 ± 0,03 3,84 ± 0,04 0,14 ± 0,00 2.82 ± 0,04 0,07 ± 0,01 0,60 ± 0,01 M14 0,33 ± 0,03 4,43 ± 0,03 0,08 ± 0,00 2,84 ± 0,03 0,05 ± 0,00 0,54 ± 0,04 M15 0,30 ± 0,02 4,66 ± 0,01 0,09 ± 0,00 3,01 ± 0,00 0,08 ± 0,00 0,20 ± 0,02 M16 0,33 ± 0,02 4,46 ± 0,03 0,13 ± 0,00 2,54 ± 0,02 0,09 ± 0,00 0,35 ± 0,01 M17 1,21 ± 0,02 4,41 ± 0,03 0,15 ± 0,00 3,05 ± 0,05 0,13 ± 0,01 0,51 ± 0,01 M18 1,18 ± 0,02 4,40 ± 0,2 0,18 ± 0,00 3,07 ± 0,04 0,18 ± 0,00 0,79 ± 0,04 M19 1,20 ± 0,04 3,05 ± 0,04 0,14 ± 0,00 3,28 ± 0,01 0,13 ± 0,00 0,82 ± 0,01 M20 0,16 ± 0,01 3,44 ± 0,05 0,08 ± 0,01 3,57 ± 0,04 0,08 ± 0,00 0,93 ± 0,03 M21 0,19 ± 0,01 1,35 ± 0,02 0,11 ± 0,01 2,88 ± 0,01 0,08 ± 0,02 0,93 ± 0,01 M22 0,14 ± 0, 01 1,33 ± 0,05 0,08 ± 0,01 3,07 ± 0,04 0,08 ± 0,00 1,16 ± 0,00 M23 0,17 ± 0.01 3,08 ± 0,04 0,10 ± 0,00 3,21 ± 0,00 0,05 ± 0,00 0,97 ± 0,01 M24 0,17 ± 0.03 3,59 ± 0,03 0,09 ± 0,00 3,33 ± 0,04 0,07 ± 0,01 1,08 ± 0,02 M25 0,15 ± 0.00 3,08 ± 0,04 0,08 ± 0,00 3,45 ± 0,05 0,05 ± 0,00 1,22 ± 0,02 M26 0,16 ± 0.03 2,79 ± 0,01 0,10 ± 0,01 3,54 ± 0,03 0,07 ± 0,01 1,27 ± 0,01 M27 0,14 ± 0.01 2,95 ± 0,05 0,06 ± 0,00 3,17 ± 0,01 0,05 ± 0,00 1,33 ± 0,00 M28 0,21 ± 0.03 4,23 ± 0,00 0,14 ± 0,00 3,03 ± 0,02 0,09 ± 0,00 1,38 ± 0,02 M29 0,95 ± 0.02 4,55 ± 0,04 0,16 ± 0,00 3,34 ± 0,03 0,15 ± 0,01 1,36 ± 0,01 M30 0,59 ± 0.03 4,08 ± 0,01 0,16 ± 0,00 3,42 ± 0,02 0,13 ± 0,01 1,30 ± 0,01 M31 0,42 ± 0.04 4,55 ± 0,04 0,14 ± 0,00 3,56 ± 0,05 0,13 ± 0,00 1,32 ± 0,03 69 En la Figura 12, se muestra el ACP, para el cadmio y su relación con las muestras, allí se aprecia que el PC1 explica el 99% del contenido de este metal en las muestras y el PC2 solamente el 1%. indico que las muestras de granos frescos secos M19, M18, M17, M29, M1, M2, M3, M10, M11 y M30, presentaron los contenidos más altos de cadmio (Cd1), variando entre 0,59 ± 0,03 (M30) – 1,21 ± 0,02 (M17) ppm y los más bajos, 20 muestras; variando entre 0,05 ± 0,01 – 0,34 ± 0,00 ppm; siendo la muestra M7, variedad FC4 del sector Pumahuasi la que presentó 0.34 ppm de cadmio. Al respecto el reglamento (UE) No 488/2014 (REGLAMENTO (UE), 2014), establecerá un contenido máximo de cadmio de 0,8 ppm para chocolate con un contenido de materia seca total de cacao ≥ 50 %, a partir de enero del año 2019. Por lo tanto, ninguna de las muestras señaladas supera este límite. También se estaría incluyendo las muestras M31, M30, M10, M11 hasta la M3 con un contenido de cadmio máximo de 0,61 ± 0,01 ppm; llegando a 25 muestras de un total de 31, que no superaron la reglamentación establecida. (BERTOLDI et al., 2016), han reportado contenidos de cadmio en granos de cacao y subproductos entre 0,0926 – 1,388 ppm y entre 0,17 – 2,16 ppm; (LEWIS et al., 2018), además indicaron que el cadmio (Cd) es un metal pesado no esencial que es tóxico tanto para las plantas como para los animales. En los seres humanos, el bajo nivel de exposición al Cd se ha relacionado con la disfunción renal, la osteoporosis y varios tipos de cáncer. 70 Figura 12. Biplot del ACP, PC1 (99%) y PC2 (1%), que explican la relación entre contenido de cadmio (Cd), y las muestras. En la Figura 13, se muestra el ACP, para el plomo y su relación con las muestras, allí se aprecia que el PC1 explica el 70% del contenido de este metal en las muestras y el PC2 el 18%. El biplot explica el 88% de la variabilidad de las respuestas, apreciándose que existieron tres grupos diferentes, las muestras de granos de cacao fresco secos, con el mayor contenido de Pb, variando entre 3,44 ± 0,05 (M20) – 4,66 ± 0,007 (M15) ppm; las de contenido medio variando entre 2,54 ± 0,03 (M2) - 3,20 ± 0,04 (M9) ppm y las muestras con los contenidos más bajos de Pb, muestras M1 (1,28 ± 0,01 ppm), M21 (1,35 ± 0,02 ppm) y M22 (1,33 ± 0,05 ppm). Según (BERTOLDI et al., 2016), han reportado contenidos de Pb en granos de cacao y derivados, procedentes de diversas partes del mundo con valores entre 0,0528 – 0,1881 ppm, el 71 REGLAMENTO (UE), (2015), ha establecido limites en el contenido de Pb en diversos alimentos que varía entre 0,01 – 3,00 ppm; de igual modo se ha indicado que el plomo podía tener graves efectos nocivos, como neurotoxicidad en los niños de corta edad, y efectos cardiovasculares y nefrotoxicidad en los adultos. Los resultados de Pb encontrados, en algunos casos superan estos límites, pero debe considerarse la cantidad de consumo que realice cada individuo y sería recomendable, profundizar el estudio de este metal, en otras muestras de granos de cacao y derivados, considerando un especial interés al método de determinación de plomo. Figura 13. Biplot del ACP, PC1 (70%) y PC2 (18%), que explican la relación entre contenido de plomo (Pb), y las muestras. 72 5.5. Contenido de polifenoles totales, antocianinas y capacidad antioxidante en los granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao En el Cuadro 17, se presenta el contenido de compuestos bioactivos en estudio; es decir el contenido de polifenoles totales (PPT) y antocianinas totales (ANT), en los granos frescos secos, fermentados seco y pasta de cacao, se presentaron como sigue. El contenido de PPT fue mayor en el grano fresco seco, lo presentó la muestra M20, de variedad Común del sector de Huayhuantillo con 5,01 ± 0,08 g AGE/ 100 g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M19, variedad Criollo del sector de Pendencia con 3,27 ± 0,04 g AGE/ 100 g de muestra. El contenido de PPT disminuyó en los granos fermentados secos, con mayor contenido en la muestra M15, variedad CCN-51 del sector de Pendencia con 3,30 ± 0,02 g AGE/100 g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M14 variedad Común del sector de Pendencia con 1,24 ± 0,03g AGE/100 g de muestra. El contenido de PPT, también disminuyó en las muestras de pasta de cacao lo presentó la muestra M18, variedad CCN-51 del sector de Pendencia con 3,12 ± 0,01 g AGE/100 g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M30, variedad Común del sector de Frontera con 1,70 ± 0,02 g AGE/100 g de muestra. PELÁEZ et al., (2016), han reportado contenidos de polifenoles totales en granos secos de cacao sin fermentar y su variación durante la fermentación, disminuyendo desde 7,0 – 5,05 ± 0,02 g AGE/100 g, en un sistema de fermentación semimecanizado. 73 Cuadro 17. Polifenoles Totales (PPT, g AGE/100 g), Antocianinas Totales (ANT, mg Cianidina-3-Glucósido/100 g) en las muestras. Nº Granos frescos secos (n = 3) Granos fermentados secos (n = 3) Pasta de cacao (n = 3) PPT ANT PPT ANT PPT ANT M1 3,73 ± 0,03 32,29 ± 0,39 2,32 ± 0,01 5,20 ± 0,19 2,48 ± 0,00 8,02 ± 0,00 M2 4,87 ± 0,02 39,98 ± 1,26 2,27 ± 0,01 3,34 ± 0,33 2,49 ± 0,01 12,81 ± 1,17 M3 4,87 ± 0,01 41,42 ± 0,33 2,33 ± 0,02 2,45 ± 0,19 2,30 ± 0,00 7,02 ± 0,00 M4 4,34 ± 0,04 17,93 ± 0,19 3,20 ± 0,01 20,38 ± 0,33 2,98 ± 0,02 12,58 ± 0,19 M5 4,00 ± 0,04 21,49 ± 0,51 2,27 ± 0,03 4,06 ± 0,35 2,41 ± 0,01 3,79 ± 0,19 M6 3,98 ± 0,02 41,54 ± 0,39 2,30 ± 0,04 3,79 ± 0,19 2,18 ± 0,02 12,58 ± 0,51 M7 4,05 ± 0,05 19,60 ± 0,19 2,75 ± 0,00 21,55 ± 1,93 2,12 ± 0,01 5,57 ± 0,19 M8 3,45 ± 0,09 39,53 ± 1,96 2,41 ± 0,03 24,89 ± 1,17 2,68 ± 0,02 12,81 ± 0,19 M9 4,60 ± 0,08 21,71 ± 0,00 1,63 ± 0,00 4,51 ± 1,37 1,82 ± 0,01 5,23 ± 0,19 M10 3,71 ± 0,06 18,37 ± 0,33 2,30 ± 0,01 19,71 ± 1,00 1,81 ± 0,02 15,37 ± 0,33 M11 4,03 ± 0,03 28,17 ± 0,39 1,34 ± 0,03 4,84 ± 0,17 1,74 ± 0,01 7,91 ± 0,19 M12 4,81 ± 0,01 36,75 ± 1,00 2,27 ± 0,00 18,21 ± 0,17 1,96 ± 0,01 4,90 ± 0,19 M13 4,14 ± 0,05 40,09 ± 1,34 1,98 ± 0,01 4,18 ± 0,17 1,95 ± 0,01 11,02 ± 0,00 M14 3,57 ± 0,01 17,04 ± 0,33 1,24 ± 0,03 15,70 ± 0,00 2,46 ± 0,03 5,01 ± 0,00 M15 4,67 ± 0,02 39,98 ± 0,19 3,30 ± 0,02 27,89 ± 1,81 2,25 ± 0,03 6,12 ± 0,19 M16 3,60 ± 0,06 22,61 ± 0,84 2,69 ± 0,00 4,34 ± 0,58 2,45 ± 0,02 12,92 ± 0,51 M17 3,41 ± 0,04 17,04 ± 0,67 2,77 ± 0,00 4.,6 ± 0,63 2,19 ± 0,02 8,57 ± 0,19 M18 3,96 ± 0,01 22,83 ± 0,19 1,80 ± 0,01 30,34 ± 0,68 3,12 ± 0,01 11,80 ± 0,51 M19 3,27 ± 0,04 31,63 ± 0,70 2,02 ± 0,01 8,57 ± 0,19 3,01 ± 0,01 12,47 ± 0,19 M20 5,01 ± 0,08 44,88 ± 0,51 2,06 ± 0,02 12,08 ± 0,35 2,95 ± 0,03 11,25 ± 0,19 M21 4,37 ± 0,03 43,43 ± 0,33 2,81 ± 0,01 29,18 ± 0,77 1,79 ± 0,01 6,12 ± 0,19 M22 3,69 ± 0,04 19,15 ± 0,19 1,83 ± 0,03 20,77 ± 0,35 2,02 ± 0,02 4,23 ± 0,19 M23 4,41 ± 0,05 18,37 ± 0,33 1,50 ± 0,01 24,33 ± 0,35 2,00 ± 0,04 3,12 ± 0,19 M24 3,56 ± 0,06 19,71 ± 0,33 2,24 ± 0,04 21,49 ± 1,68 2,11 ± 0,03 4,23 ± 0,19 M25 3,57 ± 0,02 15,14 ± 0,39 2,45 ± 0,02 10,47 ± 1,17 2,57 ± 0,02 4,34 ± 0,00 M26 3,71 ± 0,01 17,59 ± 0,39 2,01 ± 0,02 20,38 ± 0,33 2,27 ± 0,02 5,57 ± 0,19 M27 4,03 ± 0,02 27,84 ± 0,39 1,95 ± 0,02 12,03 ± 0,33 1,71 ± 0,02 6,24 ± 0,19 M28 4,17 ± 0,02 32,63 ± 0,19 2,73 ± 0,03 10,47 ± 0,84 2,14 ± 0,01 11,14 ± 0,19 M29 4,67 ± 0,03 43,87 ± 2,84 2,39 ± 0,00 7,46 ± 0,39 1,97 ± 0,02 8,57 ± 0,19 M30 3,79 ± 0,07 27,95 ± 1,51 1,84 ± 0,04 16,59 ± 0,19 1,70 ± 0,02 13,03 ± 0,00 M31 3,46 ± 0,03 10,24 ± 0,51 2,24 ± 0,01 20,88 ± 0,50 2,69 ± 0,02 11,36 ± 0,00 74 En términos generales el contenido de ANT, disminuyó, siendo mayor en el grano fresco seco y menor en las muestras de pasta. El mayor contenido de ANT en los granos frescos secos, lo presentó la muestra M20, variedad Común del sector de Huayhuantillo con 44,88 ± 0,51 mg Cianidina-3- Glucósido/100g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M31, variedad ICS-55 del sector de Frontera con 10,24 ± 0,51 Cianidina-3- Glucósido/100g de muestra. El mayor contenido de ANT en los granos fermentados secos, lo presentó la muestra M18, variedad CCN-51 del sector de Pendencia con 30,34 ± 0,68 mg Cianidina-3-Glucósido/100g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M3, variedad CCN-51 del sector de Pumahuasi con 2,45 ± 0,19 mg Cianidina-3-Glucósido/100g de muestra. El mayor contenido de ANT en las pastas de cacao, lo presentó la muestra M10, variedad Criollo del sector de José de Pucate con 15,37 ± 0,33 mg Cianidina-3- Glucósido/100g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M23, variedad Común del sector de Frontera con 3,12 ± 0,19 mg Cianidina-3- Glucósido/100g de muestra. En cuanto al contenido de antocianinas en granos de cacao, (ZAPATA et al., 2013), han reportado variaciones entre 0,16 – 0,027 g cianidina-3-glucósido/100 g, para granos fermentados y sin fermentar respectivamente. En el Cuadro 18, se presentan los resultados de Capacidad Antioxidante como Equivalente Trolox (CAET) de los granos frescos secos, fermentados secos y en la pasta de cacao. 75 Cuadro 18. Capacidad Antioxidante en los granos frescos secos, fermentados secos y en pasta de cacao (µM ET/g) ( ± DS). Nº Granos frescos secos (n = 3) Granos fermentados secos (n = 3) Pasta de cacao (n = 3) ABTS DPPH ABTS DPPH ABTS DPPH M1 461,35 ± 0,86 464,19 ± 0,49 247,17 ± 2,39 125,09 ± 0,21 311,82 ± 0,52 194,83 ± 0,42 M2 491,27 ± 0,86 481,06 ± 0,49 155,02 ± 0,00 119,29 ± 0,11 334,85 ± 1,80 154,05 ± 1,90 M3 387,55 ± 1,50 413,28 ± 0,84 224,43 ± 0,60 79,95 ± 0,21 285,79 ± 1,37 200,31 ± 0,42 M4 392,54 ± 0,86 425,38 ± 0,49 227,42 ± 1,80 124,45 ± 1,69 277,41 ± 0,90 195,25 ± 0,42 M5 450,38 ± 1,50 458,28 ± 0,49 262,73 ± 0,00 93,03 ± 0,21 223,55 ± 1,80 146,32 ± 1,27 M6 427,94 ± 2,99 444,50 ± 0,84 170,78 ± 5,09 98,40 ± 0,53 252,28 ± 0,90 91,05 ± 0,42 M7 450,88 ± 0,86 458,28 ± 0,49 235,20 ± 0,60 95,45 ± 0,53 224,45 ± 2,69 155,18 ± 0,42 M8 395,03 ± 1,50 409,06 ± 0,84 264,72 ± 1,51 107,58 ± 0,63 380,93 ± 0,52 123,26 ± 0,64 M9 344,67 ± 0,86 380,66 ± 0,49 148,04 ± 2,70 71,93 ± 1,69 383,62 ± 1,37 129,02 ± 0,42 M10 591,50 ± 3,76 513,68 ± 0,84 231,61 ± 1,80 104,52 ± 1,79 307,33 ± 1,37 187,52 ± 1,22 M11 447,39 ± 2,99 429,88 ± 1,76 249,16 ± 0,35 121,40 ± 0,74 277,41 ± 0,00 129,86 ± 0,42 M12 383,06 ± 1,50 393,88 ± 0,84 239,59 ± 0,91 137,43 ± 0,32 283,09 ± 1,37 166,35 ± 1,05 M13 445,89 ± 2,99 412,44 ± 1,69 250,96 ± 2,10 109,06 ± 1,27 219,37 ± 1,37 178,80 ± 0,84 M14 461,85 ± 3,11 438,03 ± 2,12 145,05 ± 0,35 95,77 ± 1,05 411,45 ± 0,52 192,72 ± 0,42 M15 486,28 ± 2,99 454,62 ± 2,23 227,82 ± 1,92 116,65 ± 0,21 357,29 ± 0,90 191,88 ± 0,84 M16 365,11 ± 2,99 383,75 ± 1,69 117,12 ± 2,83 69,19 ± 0,63 403,67 ± 1,37 139,15 ± 1,69 M17 407,00 ± 0,00 407,38 ± 0,00 278,88 ± 2,61 100,09 ± 0,53 377,34 ± 1,37 203,90 ± 1,90 M18 361,12 ± 0,86 381,50 ± 0,49 177,36 ± 1,73 96,72 ± 0,32 164,61 ± 1,37 138,51 ± 0,63 M19 293,31 ± 2,99 342,13 ± 2,58 116,33 ± 0,91 109,58 ± 0,53 412,34 ± 2,26 206,64 ± 3,37 M20 326,22 ± 3,96 362,10 ± 2,12 121,81 ± 1,37 70,77 ± 0,32 221,16 ± 0,52 207,06 ± 0,42 M21 482,29 ± 0,86 449,84 ± 0,49 214,56 ± 2,34 121,50 ± 0,84 206,80 ± 4,05 195,46 ± 1,05 M22 499,75 ± 2,59 459,12 ± 2,12 238,79 ± 1,20 110,32 ± 0,21 220,86 ± 1,80 192,93 ± 0,63 M23 535,15 ± 1,73 478,81 ± 2,12 206,78 ± 2,89 108,74 ± 0,11 232,53 ± 2,37 175,00 ± 0,42 M24 558,59 ± 2,29 492,87 ± 1,29 211,57 ± 1,37 112,85 ± 0,21 250,18 ± 2,59 170,92 ± 1,29 M25 534,15 ± 2,99 482,47 ± 3,37 126,00 ± 1,82 116,33 ± 0,32 329,77 ± 1,37 195,25 ± 0,42 M26 514,71 ± 1,50 476,56 ± 0,84 225,33 ± 2,89 111,69 ± 2,64 260,95 ± 1,87 189,56 ± 0,21 M27 541,63 ± 2,99 483,31 ± 1,69 177,16 ± 2,61 118,02 ± 0,32 195,43 ± 2,74 163,40 ± 1,90 M28 426,45 ± 3,96 418,34 ± 2,23 283,37 ± 1,37 117,49 ± 0,21 278,31 ± 0,90 204,32 ± 1,48 M29 327,71 ± 1,50 362,66 ± 0,84 244,18 ± 2,61 126,04 ± 0,32 262,15 ± 1,80 233,85 ± 1,48 M30 336,69 ± 2,99 370,82 ± 1,76 198,40 ± 2,34 109,16 ± 0,32 200,22 ± 1,80 216,20 ± 1,29 M31 298,29 ± 0,86 346,07 ± 0,49 187,93 ± 1,20 118,23 ± 0,11 222,36 ± 1,37 217,40 ± 1,05 76 El mayor contenido de CAET determinado por ensayo ABTS en el grano fresco seco, lo presentó la muestra M10, variedad Criollo del sector San José de Pucate con 591,50 ± 3,76 µM ET/g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M19, variedad Criollo del sector Pendencia con 293,31 ± 2,99 µM ET/g de muestra. El mayor contenido de CAET determinado por ensayo DPPH en los granos frescos secos, lo presentó la muestra M10, variedad Criollo del sector San José de Pucate con 513,68 ± 0,84 µM ET/g de muestra y el menor contenido lo presentó la muestra M19, variedad Criollo del sector Pendencia con 342,13 ± 2,58 µM ET/g de muestra. El mayor contenido de CAET por ensayo ABTS en los granos fermentados secos, lo presentó la muestra M28, variedad ICS-95 del sector Frontera con 283,37 ± 1,37 µM ET/g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M19, variedad Criollo del sector Pendencia con 116,33 ± 0,91 µM ET/g de muestra. El mayor contenido de CAET por ensayo DPPH en los granos fermentados secos, lo presentó la muestra M12, variedad CCN-51 del sector Mapresa con 137,43 ± 0,32 µM ET/g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M16, VPA-2 del sector Pendencia con 69,19 ± 0,63 µM ET/g de muestra. El mayor contenido de CAET por ensayo ABTS en pasta de cacao, lo presentó la muestra M19, variedad Criollo del sector Pendencia con 412,34 ± 2,26 µM ET/g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M18, variedad CCN-51 del sector Pendencia con 164,61 ± 1,37 µM ET/g de muestra. El mayor contenido de CAET por ensayo DPPH en pasta de cacao, lo presentó la muestra M29, variedad CCN-51 del sector Mapresa con 233,85 ± 1,48 µM 77 ET/g de muestra, y el menor contenido lo presentó la muestra M6, FC3 del sector Pumahuasi con 91,05 ± 0,42 µM ET/g de muestra. Las gráficas de puntajes del ACP de la Figura 14 y gráfica de cargas de la Figura 15, explican el 99% de la variabilidad de respuestas, apreciándose la formación de cuatro agrupamientos, de izquierda a derecha; uno formado en el PC-1, por las variables de capacidad antioxidante (ABTS1, DDPH1), de muestras de granos de cacao frescas secas, relacionadas a 10 muestras, M10, M24, M25, M23, M26, M2, M15, M27, M1, y M22. En este grupo la muestra M10, de grano fresco seco, presentó la mayor capacidad antioxidante en función a los radicales ABTS1 y DDPH1, con valores de 591,50 ± 3,76 y 513,68 ± 0,84 µM ET/g, capacidad que fue disminuyendo según la ubicación de las muestras hacia la derecha del grupo. El agrupamiento dos, formado por las variables de capacidad antioxidante (ABTS2, DPPH2), de muestras de granos fermentados secos y capacidad antioxidante (DPPH3,), de muestras de pasta de cacao, relacionadas a 10 muestras: M21, M5, M7, M11, M28, M6, M13, M4, M3 y M12. Estas muestras presentaron valores de capacidades antioxidantes intermedias, en relación a las variables indicadas. El agrupamiento tres, formado por las variables del contenido de polifenoles totales y antocianinas (PPT1, PPT2, PPT3, ANT1, ANT2, ANT3), en las muestras de granos de cacao frescos secos, granos fermentados secos y en las muestras de pasta de cacao, relacionadas con 5 muestras: M29, M18, M30, M20 y M31. Estas muestras son las que presentaron las menores capacidades antioxidantes, en el orden de izquierda a derecha, con valores de ABTS entre 78 244,18 ± 2,61 – 327,71 ± 1,50 µM ET/g y de DPPH entre 126,04 ± 0,32 – 362,66 ± 0,84 µM ET/g; con la característica de que las muestras de grano fresco seco presentaron los valores más altos y los granos fermentados secos los valores más bajos. El agrupamiento cuatro, superior, formado en el PC-2, por la variable de capacidad antioxidante (ABTS3), en las muestras de pasta de cacao, relacionada con 6 muestras: M19, M16, M9, M14, M8 y M7. En este grupo la muestra M19, de pasta de cacao, presentó la mayor capacidad antioxidante en función al radical ABTS3, con el valor de 412,34 ± 2,26 µM ET/g, capacidad que fue disminuyendo según la ubicación de las muestras hacia abajo del grupo. Figura 14. Grafica de puntajes del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que explican la relación entre las variables de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas. 79 Figura 15. Grafica de cargas del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que correlaciona las muestras y que explican la afinidad de características entre ellas, en el análisis de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas. ZAPATA et al. (2013), han reportado capacidades antioxidantes DPPH, expresados en equivalentes de trolox, en diversas muestras de granos de cacao sin fermentar y fermentados, con valores que variaron en el rango de 251,59 ± 10,62 – 464,64 ± 21,68 µM ET/g, siendo mayor en el grano sin fermentar. PEREA et al., (2009), también han reportado capacidades antioxidantes ABTS, expresados en equivalentes de trolox, en muestras de granos fermentados secos y pasta de cacao, con valores que variaron en el rango de 270,11 ± 82,40 – 361,45 ± 44,68 µM ET/g, con mayor capacidad antioxidante en los granos fermentados secos. En términos generales, los contenidos de polifenoles totales, antocianinas, capacidad antioxidante (ABTS, DDPH, expresados como uM ET/100g), encontrados en las muestras evaluadas fueron similares a los reportados en las diversas referencias citadas. 80 VI. CONCLUSIONES El análisis de componentes principales determinó que el calcio alcanzó el mayor contenido en el grano fresco seco (M26), con 3,14%. El mayor contenido de potasio en el grano fresco seco, correspondió a la muestra M13, con 2,44%. Doce muestras tuvieron mayor influencia en la variabilidad de respuesta. En el contenido de zinc, en los granos frescos secos, fue mayor en las muestras M30, M22, M23 y M9; con 90,46 ± 0,19 ppm, en M30. El contenido de cobre, varió entre 29,02 ± 0,01 – 4,07 ± 0,05 ppm, para la muestra de grano fresco seco (M4) y de pasta de cacao (M3), respectivamente. El hierro varió entre 40,51 ± 0,01 – 14,46 ± 0,01 ppm, para la muestra de grano fresco seco (M31) y para la muestra de grano fermentado seco (M3), respectivamente. Veinticinco muestras alcanzaron como máximo 0,61 ± 0,01 ppm de cadmio; valor que se encontró por debajo del contenido máximo en normas y reglamentaciones internacionales. El plomo se encontró en mayor contenido en el grano fermentado secos (M20) con 3,44 ± 0,05 ppm y el menor en (M22) con 1,33 ± 0,05 ppm. El menor contenido de Pb lo presento la pasta de cacao (M15), con 0,20 ± 0,02 ppm. El mayor contenido de polifenoles totales lo tuvo el grano fresco seco (M20), variedad Común del sector de Huayhuantillo con 5,01 ± 0,08 g AGE/ 100 81 g de muestra; el menor contenido lo presento la pasta de cacao (M30), variedad Común del sector de Frontera, con 1,70 ± 0,02 g AGE/100 g de muestra. El contenido de antocianinas fue mayor en las muestras de grano fresco seco y menor en las muestras de pasta de cacao; el mayor en la muestra (M20), variedad Común del sector de Huayhuantillo con 44,88 ± 0,51 mg Cianidina-3-Glucósido/100g de muestra, y el menor en la muestra (M31), variedad ICS-55 del sector de Frontera con 10,24 ± 0,51 Cianidina-3- Glucósido/100g de muestra. La mayor capacidad antioxidante, lo presento la muestra (M10), de grano fresco seco, en función a los radicales ABTS y DDPH, con valores de 591,50 ± 3,76 y 513,68 ± 0,84 µM ET/g. La pasta de cacao presentó la mayor capacidad antioxidante, muestra (M19), en función al radical ABTS, con 412,34 ± 2,26 µM ET/g. 82 VII. RECOMENDACIONES Que la Cooperativa Agraria Cafetalera la Divisoria Ltda. utilice los resultados de la investigación realizada, en los folletos de publicidad y comercialización de sus productos, lo cual facilitará la comercialización de los mismos. Que, en futuros trabajos, se realicen investigaciones del contenido de minerales de muestras de granos de cacao, de diversas zonas, Profundizar el estudio de contenidos de minerales y su correlación con los metales pesados, compuestos funcionales y capacidad antioxidante. Contemplar siempre las precauciones: Debido a que algunos reactivos son tóxicos, corrosivos e irritantes se recomienda el uso de guantes. Todo desperdicio líquido o sólido debe ser tratado como material tóxico y eliminados en envases adecuados. 83 VIII. ABSTRACT Thirty-one samples of fresh dry cocoa beans (GFRS), 31 dry fermented beans (GFS) and 31 samples of cocoa mass (PC) were investigated; from the Alto Huallaga, area of influence of the Cooperativa Cafetalera Divisoria; determining the macroelements phosphorus, sodium, calcium and magnesium; the microelements copper, iron, zinc, manganese; heavy metals cadmium, lead; The content of total polyphenols, anthocyanins, antioxidant capacity (CA), such as 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic acid (ABTS), was determined. expressed as trolox equivalent (ET). It turned out that calcium was the mineral with the highest content in the M26 sample of GFRS, with 3.14%; considering potassium (K1) in GFRS, the highest content was in the M13 sample, with 2.44%. Likewise, the ACP established that 12 samples influenced CP1 and CP2, in the general ACP of minerals and samples. The ACP (96%) established that the zinc (Zn1) in the GFRS, was in greater quantity in M30, M22, M23 and M9; with 90.46 ± 0.19 ppm in M30. 25 samples in each type, reached no more than 0.61 ± 0.01 ppm of cadmium; value lower than that established by the CEU as of January 2019. The content of lead was higher in the GFRS, in the M20 with 3.44 ± 0.05 ppm and lower in M22 with 1.33 ± 0.05 ppm; the lowest Pb content was presented by sample M15, of PC with 0.20 ± 0.02 ppm. It was found that sample M10, of GFRS, presented the highest CA in function of the radicals ABTS and DDPH (GFRS), with values of 84 591.50 ± 3.76 and 513.68 ± 0.84 μM ET / g; it was also determined that the sample M19 of PC, presented the highest CA in function of the radical ABTS (PC), with the value of 412.34 ± 2.26 μM ET / g. 85 IX. REFERENCIAS BIBLIOBGRAFICAS ADUREIRA, A., GOMES, A., PINTADO, M. 2015 Functional dairy ingredients. In dairy microbiology and biochemistry: recent developments. 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Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,000 *1 [1,000] 0,111 2 [2,000] 0,227 3 [4,000] 0,441 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Cu (ppm) 97 Anexo IV. Parámetros de calibración para el Fe. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,00 *1 [1,000] 0,042 2 [2,000] 0,099 3 [5,000] 0,304 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Fe (ppm) Anexo V. Parámetros de calibración para el Mn. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,000 1 [0,500] 0,087 *2 [1,000] 0,143 3 [3,000] 0,410 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Mn (ppm) Anexo VI. Gráfico del parámetro de calibración para el P. y = 0.0184x - 0.0068 R² = 0.9933 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 2 4 6 8 10 12 A b so rb an ci a (p p m ) Concentración (ppm) 98 Anexo VII. Parámetros de calibración para el Na. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,000 *1 [0,200] 0,074 2 [0,400] 0,142 3 [0,800] 0,218 4 [1,600] 0,364 5 [2,000] 0,403 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Na (ppm) Anexo VIII. Parámetros de calibración para el Zn. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] -0,001 1 [0,200] 0,05 *2 [0,500] 0,142 3 [1,000] 0,304 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (F,S,P) en Zn(ppm) Anexo IX. Parámetros de calibración para el Ca. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,000 *1 [0,200] 0,074 2 [0,400] 0,142 3 [0,800] 0,218 4 [1,600] 0,364 5 [2,000] 0,403 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Ca (ppm) 99 Anexo X. Parámetros de calibración para el Mg. Standard Conc Valor Reslope 0 [0] 0,00 1 [0,100] 0,059 *2 [0,200] 0,106 3 [0,400] 0,195 4 [0,800] 0,310 5 [1,000] 0,403 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (1,2,3) en Mg (ppm) Anexo XI. Parámetros de calibración para el K. Standard Conc Valor Reslope Standard Conc Valor Reslope 0 [0] -0,002 *1 [0,500] 0,073 2 [1,000] 0,177 3 [2,000] 0,430 Conc. Fijado en 0 AA Cal Curva para las todas las muestras (F,S,P) en K (ppm) Anexo XII. Concentración vs absorbancias para polifenoles totales [AG µg/mL] Abs ppm 10 0.091 25 0.193 50 0.441 75 0.713 100 0.953 100 Anexo XIII. Curva standard para la determinación de polifenoles totales. y = 0.0098x - 0.0313 R² = 0.9972 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 A b so rb an ci a (ug/mL) [ AG ] 101 Anexo XIV. Estándares para la elaboración la curva de calibración trolox DPPH (Concentración Vs tiempo (30 min) Estándar Concentración Cantidades X Y Control Abs. S1 1,50 mM [750 µl trolox+ 250 µL H2Od.] 1,50 0,702 0,724 0,731 0,735 0,738 0,744 0,970 S2 1,00 mM [500 µl trolox+ 500 µL H2Od.] 1,00 0,432 0,444 0,447 0,449 0,452 0,458 S3 0,50 mM [250 µl trolox+ 750 µL H2Od.] 0,50 0,218 0,232 0,242 0,270 0,273 0,276 S4 0,25 mM [125 µl trolox+ 875 µL H2Od.] 0,25 0,120 0,127 0,131 0,140 0,151 0,154 Anexo XV. Curva de calibración trolox DPPH. y = 0,9928x + 0,0427 R² = 0,9972 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 A b so rb an ci a Concentración (mM) Tiempo (30 min) 102 Anexo XVI. Estándares para la elaboración la curva de calibración trolox ABTS (Concentración Vs tiempo (30 min). Estándar Concentración Cantidades X Y Control Abs. S1 1,50 mM [750 µl trolox+ 250 µL H2Od.] 1,50 0,542 0,546 0,548 0,548 0,548 0,549 0,785 S2 1,00 Mm [500 µl trolox+ 500 µL H2Od.] 1,00 0,374 0,376 0,377 0,377 0,377 0,377 S3 0,50 mM [250 µl trolox+ 750 µL H2Od.] 0,50 0,196 0,200 0,201 0,201 0,201 0,201 S4 0,25 mM [125 µl trolox+ 875 µL H2Od.] 0,25 0,131 0,134 0,136 0,137 0,137 0,138 Anexo XVII. curva de calibración trolox ABTS. y = 0,3338x + 0,0451 R² = 0,9978 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 A b so rb an ci a (p p m ) Concentración (mM) Tiempo (30 min) 103 Anexo XVIII. Correlación de cargas de minerales, considerando grano fresco, grano fermentado y pasta de cacao, para cada componente (Figura 7). P1 K1 Na1 Ca1 Mg1 Cu1 Fe1 Zn1 Mn1 Cd1 Pb1 PC-1 -0,049755536 -0,001940481 -0,072830379 0,939150095 0,222717375 -0,162408471 0,150275052 -0,039424505 0,448112935 -0,064697154 -0,167043611 PC-2 -0,15474017 0,99710834 0,172165096 0,026930837 0,088296905 0,160163745 -0,367929876 -0,337887108 0,235707566 0,042770516 0,340751559 PC-3 0,05889196 0,045503382 -0,143159747 -0,340628624 0,068094701 -0,034183107 -0,134884045 0,227510899 -0,334751636 -0,16381298 -0,386326671 PC-4 -0,077225767 -0,059343163 -0,12119285 -0,003503536 0,046486635 0,006385257 -0,041270342 -0,160794243 -0,055962749 -0,275073022 0,195736602 PC-5 -0,606228232 -0,002213614 0,12572816 0,031344988 0,568592548 -0,458839774 -0,000124357 -0,260222793 -0,02883137 0,27929455 -0,061235406 PC-6 -0,103459805 -0,008550929 0,119779959 -0,013078494 0,047649279 0,139868081 -0,171578035 -0,226413935 -0,08272209 -0,313823938 0,007070296 PC-7 -0,303918064 0,009582842 0,146159038 0,007861044 -0,289787501 -0,158926293 -0,19508943 0,232807443 -0,250983775 -0,092309155 -0,800208449 P2 K2 Na2 Ca2 Mg2 Cu2 Fe2 Zn2 Mn2 Cd2 Pb2 PC-1 0,478205085 0,343082428 0,090518661 0,851227462 0,229216903 -0,245774508 0,005236145 0,098764218 0,507524669 -0,329046041 0,485610157 PC-2 -0,288550407 0,052039743 0,097739071 -0,011572884 0,180234477 -0,043273576 0,380406141 -0,268924117 0,204833299 -0,086998016 0,243343517 PC-3 -0,031662177 -0,163754806 -0,251373887 0,514708817 -0,132256046 -0,087017968 -0,017434305 0,170820385 -0,200428963 -0,132524848 -0,159935057 PC-4 -0,215134829 -0,063553676 0,298750222 0,098598324 -0,00683851 -0,047095887 0,397991419 0,046245836 -0,128476679 -0,244222552 0,267205864 PC-5 -0,256609976 -0,700413585 0,077933379 -0,020424828 0,210677013 0,454774618 -0,290222347 -0,052271802 0,00295852 0,016669581 -0,048377484 PC-6 0,196669295 0,595219731 0,377581269 -0,002347262 0,032045178 0,072102025 0,079904482 -0,05183965 -0,028522017 -0,175924852 0,155044511 PC-7 0,134883851 0,00994307 0,195258647 -0,013501464 0,144779921 0,182896405 -0,297257662 -0,178633094 -0,283772498 -0,010443942 -0,017160548 P3 K3 Na3 Ca3 Mg3 Cu3 Fe3 Zn3 Mn3 Cd3 Pb3 PC-1 0,459829956 0,149984539 -0,146214694 0,400706202 -0,128769711 0,294522762 -0,265913695 -0,073584385 0,594991624 -0,311754435 -0,166230947 PC-2 -0,264340997 -0,125882491 0,176845223 -0,263551593 -0,127908915 -0,415430188 0,029275293 0,017397912 0,2988455 0,088695124 -0,255035251 PC-3 -0,073429942 -0,042464864 0,149747863 0,266255975 -0,054521412 -0,032212324 0,340841025 -0,02779555 -0,006240583 -0,310269207 0,050419755 PC-4 0,064531036 -0,240051419 -0,212036386 -0,822386324 -0,155934989 0,076418258 -0,074805655 -0,070089839 -0,145879328 -0,231286913 -0,115438744 PC-5 -0,141254768 -0,751626015 0,084433496 0,127905309 0,29593125 0,025484782 0,182964996 -0,213272706 -0,190141097 -0,04675965 -0,462468266 PC-6 -0,341187835 -0,576225042 -0,266726941 0,062124018 -0,479622126 -0,241880253 -0,062766314 0,09477599 -0,056006424 -0,069543451 0,23687236 PC-7 0,052258387 -0,02106934 -0,335743099 -0,046521969 0,006244206 0,161330566 -0,134997025 -0,123301424 -0,162441403 -0,06257277 -0,217162803 104 Anexo XIX, Datos numéricos del gráfico de Influencia en los ACPs, según lo mostrado en la Figura 8, PC-1 PC-2 PC-3 PC-4 PC-5 PC-6 PC-7 M1 0,021443117 3,01245117 3,1822412 3,45399094 3,65860248 4,52198744 7,44663048 M2 0,307613194 1,3770237 1,46470058 1,61920786 2,08281755 7,36548519 8,06363297 M3 0,418218434 2,85720229 2,90431309 5,17093515 5,38111115 5,40504646 7,14117765 M4 2,7585609 2,77628803 2,84246802 3,04821587 6,10280418 6,32708979 7,85832644 M5 1,65516162 1,85787129 2,00440073 2,03041697 2,23583579 3,53913164 4,95099354 M6 0,245017618 0,647855461 4,25510979 6,99691391 9,74970436 10,2920456 10,3099518 M7 0,055988181 1,28584492 1,54446673 1,58148015 1,61591434 3,17632723 3,24473763 M8 1,14813626 2,4470582 7,24930048 7,36362171 7,40398693 8,63040352 8,6621151 M9 2,40046453 3,88060856 4,32382536 4,45949507 4,52000093 4,53483534 4,99135971 M10 3,80143213 4,96052265 5,02982426 5,09798765 5,09853029 5,17993879 5,81554365 M11 0,134131134 0,938643038 4,74263573 4,75830269 5,58469343 5,75695372 6,04990864 M12 3,94292808 4,2295785 4,54391384 7,18483067 7,18677664 7,78730965 9,06034946 M13 0,03723827 3,69162321 3,70373201 3,71374083 3,81535387 3,94922924 4,35688782 M14 1,14541936 2,06368446 2,54107785 3,32556725 6,369349 6,51630306 7,08728456 M15 0,057478733 0,985130131 1,2041862 3,41672397 4,51945591 7,25311804 7,64703178 M16 0,100308135 0,177434325 0,494068295 0,528522074 1,15058208 1,73561454 3,50091481 M17 0,383723795 0,446123868 1,8360585 4,6034627 4,61459446 6,69083691 8,2885313 M18 0,187409818 1,88707209 3,38284326 3,9073267 4,65755844 5,88293314 5,90340853 M19 0,281046093 0,293237388 0,383910149 0,43222177 2,19050622 2,32815647 2,37116575 M20 0,416203231 3,3672471 4,18682861 5,28082657 5,4858799 5,50050879 5,51317692 M21 4,15E-05 0,017221943 0,929761052 4,5275321 8,92893791 10,3796349 11,7573423 M22 3,38743663 3,52176237 3,66271281 6,05395317 9,30245018 9,40691376 13,2711964 M23 3,05235791 3,66460609 7,91807079 8,72560692 9,13024139 10,353446 11,7279644 M24 0,034498282 1,65532446 2,25655651 2,40384412 3,96114635 3,99725699 4,32784986 M25 0,661326468 1,98528886 3,2229476 7,07433367 7,10912085 9,1014061 9,7052021 M26 1,79243112 2,74170995 2,8726275 3,46156359 7,02895498 7,71454716 9,66453362 M27 0,017217528 0,636843801 2,45550489 2,71803665 2,85884857 4,6367445 4,70922756 M28 0,000154646 0,442140043 1,78446221 1,79782653 2,37794399 3,30201793 3,30229378 M29 0,359022617 0,489345968 0,61442399 0,853554964 1,31900966 1,8875773 2,79411745 M30 0,941875339 1,37780023 1,9543829 1,95551431 2,04880166 4,18280411 4,71044016 M31 0,255717307 0,285491318 0,508698225 2,45448327 2,51050496 2,66439533 5,76669884 105 Anexo XX, Datos numéricos de correlación de cargas de muestras de granos frescos secos, granos fermentados secos y pasta de cacao, para cada componente, según Figura 9, CP M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 PC-1 0,982301295 0,992235303 0,983120799 0,97146666 0,98797518 0,983921587 0,991375089 0,982344568 0,96166575 0,979928851 PC-2 -0,147925079 -0,041417085 -0,075811192 0,188596144 0,090159386 -0,067413434 -0,118086971 -0,039280832 0,267494857 0,094792977 PC-3 0,096787162 0,080138937 0,100258924 0,09014824 0,102487467 0,10873913 0,00533485 -0,062967397 0,053784512 0,157074362 PC-4 -0,037147421 -0,011411092 -0,124897912 -0,066532239 -0,042451419 0,101627745 -0,025966346 -0,160481393 -0,009184029 -0,06377127 PC-5 0,017147321 0,021126904 0,026958253 -0,079967611 -0,021203304 -0,067738496 0,005301283 -0,017243821 -0,008324118 -0,006856379 PC-6 -0,025487425 -0,080410026 0,004997154 -0,017257834 0,036848139 -0,0231147 0,033901434 -0,048056252 0,006116343 0,00305078 PC-7 0,029759757 0,011495141 -0,02059572 -0,023305459 -0,034240205 -0,004622553 -0,022413781 -0,018606693 0,009009775 -0,020901324 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 PC-1 0,991383016 0,961486816 0,98202163 0,991314411 0,991332173 0,998160839 0,993139029 0,982148468 0,997680128 0,976818204 PC-2 0,069393575 0,253489614 0,169429183 -0,011928559 0,050281324 0,009898654 -0,021957129 0,139879793 -0,038377158 -0,210080802 PC-3 0,069203347 0,069633149 -0,071384862 -0,105953157 -0,083893575 0,015064091 -0,067854196 -0,101907589 0,010853017 -0,019348824 PC-4 0,072310187 0,054554667 0,030876366 0,047144115 0,057687696 0,031683236 -0,08309038 -0,051982943 0,009458861 -0,00728163 PC-5 0,036287215 -0,013398241 0,011607426 0,054777626 0,02808593 0,029733956 0,004649893 -0,029805603 0,050439704 0,007555724 PC-6 -0,006456627 0,017376347 -0,007430338 0,004516775 -0,055671461 0,019125493 -0,035600033 0,038045533 0,009306481 -0,004376058 PC-7 0,026543107 -0,024819413 0,020355579 -0,02006213 -0,019534286 -0,021742905 0,000893802 0,007523025 -0,005879517 -0,01970993 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 PC-1 0,990100861 0,987014949 0,984422624 0,990596056 0,979326904 0,991810501 0,991446972 0,993139207 0,994129479 0,995295465 0,995630801 PC-2 0,015251745 -0,135543451 -0,13336435 0,083488382 -0,180946529 -0,023394484 0,099618442 0,048078422 0,088838108 -0,020228468 -0,047197893 PC-3 0,080501832 -0,03354878 0,099338211 -0,093809508 -0,06975054 -0,088700637 0,064506553 -0,092154972 -0,006447277 -0,083463006 0,012389258 PC-4 -0,035051536 -0,033872802 0,036982779 -0,004912781 0,036695443 0,051288627 0,026907418 -0,029300688 -0,04400314 5,18E-05 0,061072499 PC-5 0,09131936 -0,047870789 -0,009846084 0,047904968 -0,006987864 -0,063234098 -0,009124447 -0,028842947 -0,024694869 -0,009969693 -0,014898872 PC-6 0,042613607 0,005105704 0,033802707 0,007538503 0,03142814 0,025508219 -0,031879816 0,030148506 0,024247257 -0,038577523 -0,020048102 PC-7 0,031186044 0,051726297 0,006760852 0,01644857 -0,023571121 0,02137081 0,027347216 -0,000182405 -0,016653121 -0,001796774 -0,041584611 106 Anexo XXI, Datos numéricos de correlación de cargas de muestras para cada componente, en el análisis de macroelementos según Figura 10, Anexo XXII, Datos numéricos de correlación de cargas de muestras para cada componente en el análisis de microelementos según Figura 11, M4 M5 M8 M9 M10 M12 PC-1 -0,968289018 -0,990728855 -0,970742941 -0,968696594 -0,984816492 -0,979781032 PC-2 -0,21337226 -0,056087129 -0,144121364 0,107034139 -0,090986833 -0,041652434 PC-3 0,060827877 0,07658983 0,11265149 0,213815987 0,094182447 0,109113745 PC-4 -0,062098764 -0,071081162 0,105526306 -0,022543458 0,027994569 -0,028911114 PC-5 0,020313822 0,029380621 -0,006300872 0,002730594 -0,05449304 0,151989371 PC-6 -0,057001032 0,053435605 -0,091571152 -0,016831078 0,031363908 0,037561406 PC-7 0,072953396 -0,000168638 -0,010822283 -0,024695033 -0,089638799 0,020618739 M14 M22 M23 M25 M26 M30 PC-1 -0,919671655 -0,964473426 -0,959559917 -0,900250554 -0,932958424 -0,949308217 PC-2 -0,305859894 0,243413657 0,232199281 -0,327318609 -0,026572563 0,275538236 PC-3 -0,023259698 0,019251596 -0,072430603 -0,243661404 -0,313237727 -0,131169766 PC-4 -0,159506619 0,078865506 -0,033390176 0,138641894 -0,114650279 0,004061116 PC-5 -0,154816538 -0,027549287 -0,126310378 0,003097014 0,058216997 0,039757203 PC-6 0,087328158 0,002628784 -0,041906413 0,046756543 -0,102622449 0,047359936 PC-7 0,03094689 0,047964558 0,026646348 0,017292043 -0,05655494 -0,010168218 M4 M5 M8 M9 M10 M12 PC-1 0,961449564 0,983200312 0,977697313 0,94405973 0,970435798 0,94474566 PC-2 -0,25830242 -0,151058972 0,052250762 -0,325406522 -0,18498759 -0,313736618 PC-3 0,038374554 0,093970276 -0,029304845 -0,046490144 0,139642507 -0,033150401 PC-4 -0,066769086 -0,008524434 -0,195283011 0,008039056 -0,03493955 0,084403321 PC-5 0,049174346 -0,008713773 -0,043190323 -0,00365668 -0,049669225 0,00238518 PC-6 -0,016223272 0,031129094 0,018344663 0,006517882 0,005255329 -0,00113903 PC-7 0,011736927 -0,016276538 0,003292572 -0,021330101 0,026328763 0,024053531 M14 M22 M23 M25 M26 M30 PC-1 0,988945127 0,9866575 0,980334461 0,975604892 0,991903245 0,994349241 PC-2 0,045980834 0,145852566 0,094942488 0,212713644 0,051720098 0,043241251 PC-3 -0,115280725 0,028645637 0,161859944 -0,002287821 -0,08249753 -0,083434634 PC-4 0,048465777 -0,057042275 0,057977453 0,039416976 0,036596924 -0,028630219 PC-5 -0,063566245 0,031221284 -0,006935671 -0,01241166 0,071620576 -0,007972714 PC-6 0,001227979 -0,000343616 -0,014957883 0,023017511 0,012404681 -0,038044676 PC-7 -0,012169941 -0,010488267 -0,008531845 0,025826102 -0,000522051 0,006543146 107 Anexo XXIII, Datos numéricos de correlación de cargas del cadmio para cada componente, según se muestra en la Figura 12, CP Cd1 Cd2 Cd3 PC-1 0,999961436 0,720231295 0,694240332 PC-2 -0,00877906 0,615269482 0,597739697 PC-3 2,00E-05 -0,320484489 0,400920719 Anexo XXIV, Datos numéricos de correlación de cargas del plomo para cada componente, según se muestra en la Figura 13, CP Pb1 Pb2 Pb3 PC-1 0,999498844 0,15169923 0,067493722 PC-2 0,007992077 0,300968379 -0,973996639 PC-3 0,030629238 -0,941491067 -0,216275603 Anexo XXV, Datos numéricos del gráfico de puntajes del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que explican la relación entre las variables de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas, Figura 14, PC-1 PC-2 PC-3 PC-4 PC-5 PC-6 PC-7 PPT 1 742,459839 -16,7181969 30,8795624 -7,18549728 2,19128227 -7,31072521 -2,29260635 ANT 1 764,644836 -17,314106 32,6064987 -8,37124252 0,178068161 -6,78240013 0,165233612 ABTS 1 -1679,38867 -164,221939 116,734306 -14,493187 -51,7129669 9,77070045 -0,078540802 DPPH 1 -1631,6626 -58,0779037 18,4247818 14,8756714 69,9127655 -20,7656422 0,010379791 PPT 2 752,427185 -16,6200256 31,224062 -8,05147934 0,812683105 -6,93464947 0,830734253 ANT 2 764,720459 -17,3379993 32,6221237 -8,36634064 0,157535553 -6,77780533 0,203659058 ABTS 2 -384,771942 -73,8007813 -218,781708 -98,9537506 -13,8727455 -6,24970722 -0,025894165 DPPH 2 170,786392 -20,5174637 -28,6365356 18,5392704 25,3442574 66,6260376 -0,005002171 PPT 3 752,346497 -15,9367914 31,84828 -7,31455612 1,7011013 -7,07291317 1,06127548 ANT 3 764,752136 -17,3167591 32,622139 -8,37208939 0,166046143 -6,78640938 0,198871613 ABTS 3 -805,523193 387,934387 25,4888783 -36,4956055 -10,6313152 2,3251524 -0,054475784 DPPH 3 -210,791275 29,9275818 -105,032417 164,18895 -24,246603 -10,0417147 -0,013587952 108 Anexo XXVI, Datos numéricos del gráfico de cargas del ACP, PC1 (94%) y PC2 (2%), que correlaciona las muestras y que explican la afinidad de características entre ellas, en el análisis de capacidad antioxidante, polifenoles y antocianinas, Figura 15, M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 PC-1 -0,998861492 -0,991007864 -0,993852913 -0,995381474 -0,987481654 -0,987849474 -0,991697311 -0,971993625 -0,958807409 -0,994054735 PC-2 0,01185827 0,04342952 0,046639826 0,020413082 -0,122402884 -0,042669736 -0,113442369 0,164433628 0,269005477 -0,070388101 PC-3 -0,043670338 0,121093385 -0,079051346 -0,083622813 -0,051756814 0,096263737 -0,020899104 -0,063524105 0,062313795 0,066428334 PC-4 -0,011475763 -0,000737227 0,020701557 0,021538721 -0,071168296 -0,08204788 -0,035109308 -0,154981837 -0,053134713 -0,017250739 PC-5 0,005389566 0,030444153 -0,002227311 0,034520086 0,028022632 0,079522915 0,031782359 0,003670422 0,027278287 -0,045372423 PC-6 0,008212107 0,020652771 -0,058183957 0,012179706 -0,036841877 0,001263812 -0,031251654 0,011056165 -0,029325048 -0,011550287 PC-7 -0,038244024 -0,038758025 -0,040049501 -0,03798366 -0,036476348 -0,036280576 -0,036483452 -0,038873911 -0,04065901 -0,038033571 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 PC-1 -0,99360019 -0,992067039 -0,990098 -0,975494564 -0,996807456 -0,949962497 -0,977298081 -0,987436891 -0,91231662 -0,981478274 PC-2 -0,031960294 0,037046935 -0,115145527 0,189799041 0,068895489 0,287966996 0,154914126 -0,141833931 0,395292759 0,034501508 PC-3 -0,025889568 -0,097495735 -0,072336763 0,10203398 0,006966749 0,116619281 -0,123614997 -0,018666297 0,007114521 0,00218289 PC-4 -0,100449659 -0,038317584 -0,016924171 0,031019077 -0,018434737 -0,017055964 -0,05150988 0,014688961 0,101401746 0,176170498 PC-5 0,008321335 0,017353714 -0,03031075 -0,031688042 -0,033602648 0,00818761 -0,051163614 0,065282986 0,011064202 0,027721286 PC-6 0,03018073 0,056242451 0,003605736 -0,003071755 0,010669131 -0,02607864 -0,018406553 -0,003819457 0,031142274 -0,060682535 PC-7 -0,039812669 -0,041408382 -0,039191086 -0,039343447 -0,040393446 -0,037875693 -0,039725497 -0,035788842 -0,037485946 -0,038678523 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 PC-1 -0,987795472 -0,989423513 -0,988528848 -0,989089727 -0,985059381 -0,995666325 -0,976282537 -0,989711404 -0,97083652 -0,981930614 -0,975353777 PC-2 -0,148353562 -0,141570702 -0,137415066 -0,126637921 0,021828493 -0,089247003 -0,188714117 -0,015157091 0,062099922 -0,047867939 0,038041074 PC-3 -0,004877537 -0,017490026 0,059734609 0,072028585 0,153891817 0,018891735 0,100613758 -0,137107 -0,216559663 -0,134658411 -0,162680447 PC-4 0,044912893 0,013032605 0,008840663 -0,005626339 0,070201702 0,007587232 0,029016545 -0,022337126 0,079177298 0,121133648 0,13762027 PC-5 -0,005579164 -0,022059906 -0,016759792 -0,020611333 -0,014721231 -0,015896339 0,004758254 -0,030748151 -0,004924825 0,026347065 0,036787082 PC-6 0,013470454 -0,006097001 -0,000755482 0,004720335 0,018922765 -0,004073927 0,016566118 0,001615138 0,020794157 -0,003974701 0,021902641 PC-7 -0,037683673 -0,037364394 -0,038114194 -0,036737442 -0,037019774 -0,037511982 -0,036184039 -0,039661214 -0,040913619 -0,03804896 -0,037106764