UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA Facultad de Recursos Naturales Renovables CALIDAD MICROBIOLOGICA DEL AIRE Y SUPERFICIES EN INTERIORES DEL COMEDOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA – TINGO MARIA Tesis PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE: INGENIERO AMBIENTAL MANSILLA VALLES, Luis Manuel TINGO MARIA – PERU 2019 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA Facultad de Recursos Naturales Renovables ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL CALIDAD MICROBIOLOGICA DEL AIRE Y SUPERFICIES EN INTERIORES DEL COMEDOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA – TINGO MARIA Autor : MANSILLA VALLES, Luis Manuel Asesor : Ing. BETETA ALVARADO, Víctor Manuel Programa a investigar : Microbiología Línea de investigación : Biodiversidad Eje temático de investigación : Caracterizar microrganismos del suelo, agua y aire Lugar de ejecución : Laboratorio de Microbiología - UNAS DURACIÓN Fecha de inicio : 03 de mayo del 2019 Termino : 03 de noviembre del 2019 Financiamiento Propio : S/. 6,671 INDICE Página I. INTRODUCCION ......................................................................................... 1 1.1. Objetivo general ..................................................................................... 2 1.1.1. Objetivos específicos ...................................................................... 2 II. REVISION DE LITERATURA ...................................................................... 3 2.1. Aerobiología .................................................................................................. 3 2.1.1. Aeromicología ................................................................................. 4 2.1.2. Aerobacteriología ............................................................................ 4 2.1.3. Biometeorología .............................................................................. 4 2.2. Contaminación del aire .......................................................................... 4 2.2.1. Microorganismos presentes en el aire ............................................ 5 2.2.2. Tipos de microorganismos presentes en el aire ............................. 5 2.2.3. El aire como medio de transmisión y hábitat de microorganismos . 6 2.2.4. Contaminación en superficies ......................................................... 8 2.2.5. Microorganismos ............................................................................ 8 2.3. Mecanismos de contaminación en ambientes internos ......................... 9 2.3.1. Contaminantes físicos .................................................................... 9 2.3.2. Contaminantes químicos ................................................................ 9 2.3.3. Contaminantes Biológicos .............................................................. 9 2.4. Factores que intervienen en el crecimiento microbiano ........................... 9 2.4.1. Bacterias ....................................................................................... 11 2.4.2. Fungi (Hongos) ............................................................................. 12 2.5. Elementos climáticos que actúan en el proceso de los microorganismos…..................................................................................... 14 2.5.1. Humedad relativa .......................................................................... 15 2.5.2. Temperatura ................................................................................. 15 2.5.3. Oxígeno ........................................................................................ 16 2.5.4. Materia orgánica ........................................................................... 16 2.6. Patogenicidad de los microorganismos .................................................... 16 2.7. Grado de contaminación microbiana ambiental ...................................... 17 2.8. Comedor ...................................................................................................... 17 III. MATERIALES Y METODOS ...................................................................... 19 3.1. Lugar de ejecución .............................................................................. 19 3.1.1. Ubicación política .......................................................................... 19 3.1.2. Ubicación geográfica .................................................................... 19 3.1.3. Aspectos ambientales ................................................................... 20 3.2. Materiales ............................................................................................ 21 3.2.1. Medios de cultivos para pruebas bioquímicas .............................. 21 3.2.2. Reactivos ...................................................................................... 21 3.2.3. Equipos ......................................................................................... 22 3.3. Métodos ............................................................................................... 22 3.3.1. Tipo de investigación .................................................................... 22 3.3.2. Variables dependientes ................................................................ 22 3.3.3. Variables independientes.............................................................. 22 3.3.4. Diseño experimental ..................................................................... 22 3.3.5. Reconocimiento del área de estudio ............................................. 24 3.3.6. Muestreos ..................................................................................... 24 3.3.7. Preparación de BHI para muestreo .............................................. 25 3.3.8. Determinación de bacterias del aire ............................................. 26 3.3.9. Determinación de fungí del aire .................................................... 26 3.3.10. Recuento de microorganismos ..................................................... 27 3.3.11. Preparación de medios de enriquecimiento .................................. 28 3.3.12. Cultivo en medios enriquecedores ................................................ 29 3.3.13. Pruebas de diferenciación bioquímica .......................................... 29 3.3.14. Coloración de bacterias ................................................................ 32 3.3.15. Microcultivo fúngico ...................................................................... 33 3.3.16. Reconocimiento de riesgos potenciales para la salud .................. 34 IV. RESULTADOS .......................................................................................... 35 4.1. Bacterias y fungi del aire interno y en diferentes superficies del comedor. .............................................................................................. 35 4.1.1. Microorganismos a partir del aire .................................................. 35 4.1.2. Microorganismos a partir de superficies ....................................... 36 4.2. Identificación de bacterias ................................................................... 38 4.2.1. Bacterias encontradas a partir del aire ......................................... 38 4.2.2. Bacterias encontradas a partir de superficies ............................... 39 4.3. Identificación de fungí .......................................................................... 40 4.3.1. A partir del aire ............................................................................. 40 4.3.2. A partir de la superficie ................................................................. 41 4.4. Riesgos potenciales a la salud por la presencia de microorganismos en el aire y superficie ........................................................................... 43 V. DISCUSIÓN ............................................................................................... 47 VI. CONCLUSIONES ...................................................................................... 50 VII. RECOMENDACIONES .............................................................................. 51 ABSTRACT ................................................................................................... 52 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA ............................................................... 53 IX. ANEXOS .................................................................................................... 60 INDICE DE CUADROS Cuadros Páginas 1. Número de microorganismos UFC/cm3 de aire en los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva ........................................................................................................ 35 2. Número de microorganismos UFC/cm2 de superficie en los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. .. 37 3. Cuadro resumen, bacterias presentes en el aire por punto de muestreo en el comedor UNAS................................................................................ 39 4. Cuadro resumen, bacterias presentes en la superficie por punto de muestreo en el comedor UNAS. ............................................................... 40 5. Géneros de Fungí presentes en el aire por zona de muestreo en el comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva......................... 41 6. Géneros de Fungí presentes en la superficie por zona de muestreo en el comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. .................... 42 7. Riesgos potenciales y tratamiento para bacterias encontrada. ................ 43 8. Riesgos potenciales y tratamiento para fungi encontrados. ..................... 46 9. Bacterias identificadas en pruebas bioquímicas de la primera repetición. 61 10. Bacterias identificadas en pruebas bioquimicas de la segunda repetición. ..................................................................................................... 62 11. Bacterias identificadas en pruebas bioquímicas de la tercera repetición. ..................................................................................................... 63 12. Promedios de UFC/cm3 en dilución 103 en aire. .................................... 64 13. Promedios de UFC/cm2 en dilución de superficie. ................................. 64 14. Especies bacterianas en los puntos de estudio, aire. ............................. 65 15. Especies bacterianas en los puntos de estudio, superficie. ................... 65 16. Género fungí identificadas en los puntos de estudios, aire. ................... 66 17. Género fungi identificadas en los puntos de estudios, superficie. .......... 66 18. Número de especies bacterianas identificadas en aire y superficie. ...... 66 19. Número de especies de fungi identificadas en aire y superficie. ............ 67 20. Perú se encuentra en la latitud -9.1899672 y longitud -75.015152. ....... 67 21. Tabla del IMVIC. ..................................................................................... 67 22. Tabla de identificación de bacterias por reacciones diagnósticas, clave para separar los distintos géneros de bacterias entéricas (BROCK, 1991) ...................................................................................................... 68 INDICE DE FIGURAS Figuras Páginas 1. Mapa del comedor y Laboratorio de Microbiología General. ........................ 20 2. Flujograma ................................................................................................... 23 3. Plano de las áreas del comedor (elaboración propia). ................................. 24 4. Cálculo del número de microorganismos por el método de diluciones seriadas........................................................................................................ 28 5. Cantidad porcentual de organismos en el aire. ............................................ 36 6. Cantidad porcentual de organismos en superficies. ..................................... 38 7. Laboratorio de Microbiología General donde se analizó las muestras. ........ 69 8. Balanza analítica y balanza analíticas digital, usadas para los análisis. ...... 69 9. Incubadora de 37°C y horno usado para análisis. ........................................ 70 10. Baño María usado para los análisis............................................................ 70 11. Autoclave y baño maría usados para los análisis. ...................................... 71 12. Contador de colonias e incubadora a temperatura ambiente. .................... 71 13. Refrigerador usado para conservar las muestras. ...................................... 72 14. Microscopio electrónico usado para los análisis. ........................................ 72 15. Reactivos usados en el análisis de aire y superficie................................... 73 16. Preparado de caldo BHI en 100ml de H2O en matraces Erlenmeyer. ........ 73 17. Materiales de muestreo de aire transportados en caja hermética. ............. 74 18. Toma de muestra de aire en la entrada del comedor de la UNAS. ............ 74 19. Toma de muestra de aire en el centro del comedor de la UNAS. .............. 75 20. Toma de muestra de aire en la cocina del comedor de la UNAS. .............. 75 21. Toma de muestra de superficies de la entrada del comedor de UNAS. ..... 76 22. Toma de muestra de superficies del centro del comedor de la UNAS. ...... 76 23. Toma de muestras de superficie de la cocina del comedor de la UNAS. ... 77 24. Aislamiento de bacterias y fungi en placas Petri. ....................................... 77 25. Pesado de reactivos. .................................................................................. 78 26. Medios enriquecedores (CLED, Mac Conkey, Manitol Salado, M77). ........ 78 27. Preparación de medio enriquecedor Mac Conkey. ..................................... 79 28. Preparación de medio enriquecedor M77. .................................................. 79 29. Preparación de medio enriquecedor Manitol Salt. ...................................... 80 30. Preparación de medio enriquecedor CLED. ............................................... 80 31. Medios enriquecedores preparados. .......................................................... 81 32. Sembrado de bacterias de los matraces hacia los medios enriquecedores. ......................................................................................... 81 33. Tubos esterilizados para las pruebas bioquímicas. .................................... 82 34. Tubos listos para el sembrado de bacterias (pruebas bioquímicas). .......... 82 35. Siembra por puntura, estrías y enjuague en pruebas bioquímicas. ............ 83 36. Colorantes usados en reacciones bioquímicas. ......................................... 83 37. Agregando los colorantes a las pruebas bioquímicas. ............................... 84 38. Lectura de pruebas bioquímicas. ............................................................... 84 39. Lectura de pruebas bioquímicas. ............................................................... 85 40. Preparado de placas para el cultivo de fungi. ............................................. 85 41. Preparación para el cultivo de fungi. .......................................................... 86 42. Micro cultivo de fungi. ................................................................................. 86 43. Prueba de coloración.................................................................................. 87 44. Prueba de coloración................................................................................. 87 45. Muestras de hongos en láminas porta objetos y cubre objetos. ................. 88 46. Observando bacterias y fungi por medio de un microscopio. ..................... 88 47. Enterobacter sp observado mediante la visualización microscópica (100X). ................................................................................................................... 89 48. Lactobacillus sp observado al microscopio con aumento de 100X. ........... 89 49. Staphylococcus sp observados al microscopio con aumento de 100X. ..... 90 50. Geotrichum sp observado al microscopio con aumento de 40X. ................ 90 51. Aspergillus sp observado al microscopio con aumento de 40X. ................. 91 52. Fusarium sp observado al microscopio con aumento de 40X. ................... 91 AGRADECIMIENTO Agradezco en primer lugar a Dios por protegerme, por guiarme durante mi vida universitaria y por darme las fuerzas necesarias para poder superar obstáculos y lograr mis objetivos. A la Universidad Nacional Agraria de la Selva, mi Alma Mater, por recibirme y albergarme en sus aulas para poder formarme como profesional. A los docentes de la Facultad de Recursos Naturales Renovables y a los docentes del Departamento de Ciencias Ambientales, por entregarme sus conocimientos y experiencia profesional que fueron esenciales para la realización de mi carrera profesional. A mi asesor, el Ing. MSc. Víctor Manuel Beteta Alvarado, por la amistad, conocimientos y orientación para la realización del presente trabajo. Al Dr. Mcblgo, Cesar Samuel López López, por la amistad, orientación, apoyo y conocimientos brindado en el desarrollo del presente trabajo de investigación. Al Blgo. Cesar Gozme Sulca, por la amistad y apoyo entregado en la realización de este trabajo de investigación. Al Ing. Richard Sías Rodríguez, por brindarme su amistad, apoyo y conocimientos en el laboratorio de Microbiología General durante la investigación. A mis padres, Manuel Luis Mansilla Acosta e Yrma Yolanda Valles Rodríguez, por la confianza y apoyo brindado, porque nunca dejaron de creer en mí y porque a pesar de mis faltas y errores nunca me dejaron de demostrar su amor y sé que están orgullosos de la persona en la que me he convertido. A mis amigos, Alejandro Suárez, Marlon Pascal, Reynoso Bartolo y demás colegas por su amistad, compañía y apoyo. A todas aquellas personas que directa o indirectamente hicieron posible la culminación del presente trabajo. DEDICATORIA A Jehová, mi Dios por sobre todas las cosas, por iluminarme y acompañarme en cada momento de mi vida, por darme las fuerzas necesarias para seguir en este camino de mi formación profesional. A mis padres, Yrma Yolanda Valles Rodríguez y Manuel Luis Mansilla Acosta por su amor incondicional, porque nunca me dejaron solo, por la confianza que me dieron y porque siempre están impulsándome a luchar y pelear por mis sueños, este título es en gran parte por y para Uds. A mis hermanas Tatiana, Miluska y Romy Mansilla Valles, por sus grandes amistades, por el apoyo y el aliento incansable para que este logro se haga realidad. A mis maestros, por su tiempo, por su apoyo así como por la sabiduría que me transmitieron en el desarrollo de mi formación profesional. A la Universidad Nacional Agraria de la Selva y en especial a la Facultad de Ingeniería Ambiental, que me dieron la oportunidad de ser parte de ella. RESUMEN Mediante un análisis microbiológico del comedor, se logró aislar bacterias y fungi del aire interno y superficies del comedor. Se determinó que el aire y las superficies dentro del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva presentan microorganismos (bacterias y fungi). Se hizo los análisis en dos (2) componentes ambientales: aire y superficie en tres (3) puntos de muestreo: P1 entrada del comedor, P2 centro del patio del comedor, P3 cocina del comedor. Los tres muestreos se realizaron en los meses de Junio, Agosto y Octubre respectivamente, siendo a la 1pm la hora elegida para la toma de las muestras. Se determinó e identificó la contaminación del aire por microorganismos en el comedor, estos fueron: Enterobacter agglomerans, Staphylococcus sp, donde la bacteria Staphylococcus sp resultó la más patógena. A través de pruebas bioquímicas se encontró 5 especies de bacterias en el aire y 7 especies de bacterias en la superficie. Y mediante la prueba de microcultivo se halló 3 especies de fungi en el aire y 3 especies de fungi en superficie. En total se encontraron 8 especies bacterianas dentro del comedor, las cuales fueron: Enterobacter agglomerans, Enterobacter hafnia, Enterobacter sp, Klebsiella pneumoniae, Proteus morganii, Serratia marcescens, Staphylococcus sp, Lactobacillus sp, y 3 especies de fungi, las cuales fueron: Geotrichum sp, Aspergillus sp y Fusarium sp. Se detectó los riesgos potenciales a la salud por la presencia de microorganismos (bacterias y fungi) encontrados en los diferentes puntos del comedor, durante el desarrollo del presente trabajo de tesis. La calidad resultante es moderada. 1 I. INTRODUCCION El aseo y la desinfección son técnicas de mucho interés, estos métodos nos permiten mantener en equilibrio la aparición de microorganismos, tanto de bacterias como de fungí en la superficie. La desinfección es un tratamiento que conlleva la eliminación de microorganismos dañinos (forma vegetativa), por medio de la utilización de compuestos químicos o físicos agregados en superficies inertes. En el comedor de la universidad nacional agraria de la selva, el aseo y desinfección debe ser realizado con mucha frecuencia, las personas que trabajan en contacto con alimentos deben tener un mayor cuidado y tomar decisiones para prevenir la contaminación del ambiente, de los equipos de trabajo, muebles y del personal. La calidad microbiológica del ambiente de la investigación, nos da a conocer el número de microorganismos que existe en una zona. Los individuos también pueden ser un medio u origen contaminante, pues nosotros soltamos un gran número de moléculas al estornudar, desplazarnos, expectorar, perdida de piel, etc. Varias moléculas al azar, logran transportar microorganismos, estos tienen la facilidad de contaminar los elementos con que se trabaja; en este sentido los antisépticos, que tienen que utilizarse por los trabajadores del comedor para poder desinfectarse la epidermis y tejidos antes de ingresar a sus lugares de trabajo. 2 Por tal motivo, es que este proyecto será necesario para determinar diferentes superficies en la calidad microbiológica del aire y del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, con la finalidad de identificar microorganismos (bacterias y fungí) presentes en el aire y superficies en dicho ambiente, porque, tanto los alumnos como el personal encargado de la cocina merece contar con un ambiente limpio. Por lo antes mencionado, se plantea la siguiente interrogante ¿Cuál es la calidad microbiológica del aire y superficies en interiores del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva? Con respecto a lo antes mencionado, planteamos la siguiente hipótesis: El aire y la superficie de diferentes puntos dentro del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva cuenta con un nivel moderado de contaminación. 1.1. Objetivo general Determinar calidad microbiológica del aire y superficies en interiores del comedor de la universidad nacional agraria de la selva – Tingo María 1.1.1. Objetivos específicos - Aislar las bacterias y fungí (hongos) en medios de cultivos presentes en el aire interno y en diferentes superficies del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. - Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias. - Realizar microcultivo para la identificación de fungí (hongos). - Detectar los riesgos potenciales a la salud por la presencia de microorganismos en el aire y superficie en los puntos de estudio. 3 II. REVISION DE LITERATURA 2.1. Aerobiología En la antigüedad, el vocablo Aerobiología fue agregado como una ciencia multidisciplinaria por Fred C. Meier, que se ocupa del estudio de partículas de origen biológica aerovagantes en la atmósfera como son las bacterias, partes de líquenes y esporas de hongos. Indico que la Aerobiología “incluía el estudio de todas las partículas, tanto viables como no viables, que son transportadas pasivamente por el viento bajo la acción de las propiedades atmósfericas” (GREGORY, 1973). (NILSSON, 1992) Parte de la biología que se ocupa de los microrganismo, del cual se estudia partículas orgánicas tales esporas de hongos, bacterias, polen suspendidos en el aire se denomina Aerobiología. Esta ciencia, se ha ido ganando poco a poco un nombre hasta lograr abarcar aún más áreas de aplicación científica. Todas sus ramas de estudio son asociadas e interdisciplinarias, y estas necesitan la ayuda de demás áreas de estudio (agronomía, medicina, física, botánica, zoología, ecología, etc.) (FERNANDEZ, S. 2012). Es una ciencia muy extensa, se relaciona muy estrechamente con la botánica y una relación selectiva con la alergología. (MORALES et al., 2004). La aerobiología incluye ramas como la aeromicología, que se encarga del análisis de la variación en el tiempo y espacio de la carga fúngica en la atmósfera; biometeorología, esta ciencia está encargada de ver y estudiar la 4 interacción que tienen los organismos con los procesos atmosféricos (AIRA et al., 2005). 2.1.1. Aeromicología La aeromicología está encargada de investigar los acontecimientos, cambios espacial y temporal de la carga fúngica de la atmósfera, como también el dominio de las causas meteorológicas sobre dichas variaciones (MORALES et al., 2004). 2.1.2. Aerobacteriología Es la ciencia que se encarga del estudio de las bacterias que se encuentran presentes en el aire, así sea en exteriores (patios, calles, medio ambiente, etc.) como en interiores (casas, hospitales, mercados, etc.) (HERRERA, K. 2009). 2.1.3. Biometeorología (AULICIEMS, A. 1981) Es la ciencia que estudia interdisciplinaria relación de tierra y la biosfera la cual se denomina biometeorología. 2.2. Contaminación del aire (VAQUERO DE LA HOZ, 2011). La contaminación del aire es una de los principales riesgos de salud humana a nivel mundial, la expulsión de fábricas, esporas, el moho, están suspendidas de partícula solido suspendida. La toxicidad del aire contaminado es dañino al ser humano ya que presenta determinado problemas de salud entre ello riesgo de problemas del corazón y pulmón, a los mayores de la tercera edad y contaminados no solo en el exterior, también en el interior casas comedores donde afecta la salud. 5 2.2.1. Microorganismos presentes en el aire El aire se estudia mediante la ciencia denominada “Aerobiología” sobre la cual, DE LA ROSA et al. (2002) menciona que la aerobiología es una ciencia multidisciplinar. Los aspectos aplicados al aire en la dispersión tiene el siguiente: supervivencia, movimiento y comportamiento en la cual interactúa en la parte de microorganismo en flora y fauna. PASTOR (2010) La dispersión de los microorganismo que están en espacio es de gran utilidad para la investigación ya que afecta flora, fauna y seres humanos y coopera con la degradación de metales. Los microorganismos se trasladan a través de partículas de polvo, células, roció, hojas secas, al estornudar, hablar o toser. La actividad de manufactura o sector agrario, así como la presencia de seres vivos en la zona influye en la cantidad de microorganismos en el aire. (KONEMAN, et al. 2008) 2.2.2. Tipos de microorganismos presentes en el aire Microorganismos como hongos, bacterias y virus se encuentran en el aire. Dichos microorganismos se encuentran como células vegetativas y frecuentemente en fase de esporulación; metabólicamente menos activas las esporas y tolerantes a los cambios atmosféricos. Con frecuencia en el aire se separan bacterias esporuladas del genero Clostridium, Actinomicetos y Bacillus (UNDERWOOD, 1992). 6 2.2.3. El aire como medio de transmisión y hábitat de microorganismos Los microorganismos utilizan el aire como medio de dispersión veloz y global; los microorganismos presentes en la atmosfera no son autóctonos, así mismo es notable la propagación de estos y entre la hidrosfera, atmosfera y litosfera en forma gaseosa. De todas maneras la atmosfera no tiene la gran cantidad de microorganismos en su interior por no poseer un ambiente adecuado, sin embargo la troposfera, en las nubes posee concentración de dióxido de carbono, agua y luz, el cual hace de este un ambiente adecuado para el crecimiento microbiano fotoautótrofos. (ATLAS y BARTHA, 2002) La atmosfera posee una congregación de componente orgánico en la atmosfera de zonas industriales, permite el incremento de microorganismos heterótrofos. No obstante, la «vida en el aire» aún no ha sido comprobada, por lo que su práctica es mínima. Los microorganismos se dispersan de manera de bioaerosoles, el cual les permite trasladarse extensas distancias a través del aire. En algunos casos los microorganismos han tenido adaptaciones las cuales facilitan su dispersión y supervivencia en la atmosfera. La importancia económica y biológica de los microorganismos en el aire es considerable; ya que son causante de enfermedades de plantas por la propagación de virus, bacterias y hongos, el cual afecta a la producción (WAGGONER, 1983). Algunas enfermedades y brotes epidémicos en el hombre y animales, son producidos por virus, hongos y bacterias trasmitidas por la atmosfera. La contaminación de alimentos y la alteración de materiales 7 orgánicos como cuero, textiles, papel, otros; son producto de los microrganismos en el aire. Si bien es cierto que los microrganismos a través de su metabolismo (transformando la materia orgánica), producen gases en la atmosfera como anhídrido carbónico, amoníaco, óxido nitroso, óxido nítrico, sulfhídrico; estos son emitidos en pequeñas cantidades comparadas por las emitidas por el ser humano y sus actividades industriales; estos gases contribuyen en el deterioro de ambientes como pinturas, y la corrosión de metales y piedras en monumentos (STETZENBACH, 1997). (MIQUEL Y CAMBERT, 1901) En la antigüedad se observó una gran cantidad de corpúsculos en el aire. Lucretius (55 a.C.) de las cuales se observaron destellos de polvo brillando en el rayo de luz de la cual concluyo que fue innumerables átomos, más tarde se ratificó que eran microorganismo en el aire gracias al descubrimiento del microscopio. El botánico napolitano observo hongos en forma de esporas, Valerius Cordus, en el siglo XVI, pero fue Micheli en el siglo XVII, el que realizó representaciones graficas de esporas de moho transmitidas en el aire Pero Pasteur fue el primero que realizo estudios exactos de bacterias en el aire, a través de la perfección de procedimientos, demostrando que no existe generación espontánea. Pasteur utilizo un método que consistió en el traslado y colocado en un tubo de vidrio, para ser disuelto en alcohol el volumen de aire que fue aspirado por algodón-pólvora – éter. Las partículas de aire con esporas de hongos y baterías fueron depositadas en el líquido. Pasteur escribió en 1862: «Hay constantemente en el aire un número variable de corpúsculos cuya forma y estructura anuncian que son organizados. Sus 8 dimensiones se encuentran alrededor de 1:100 mm. Unos son esféricos, otros ovoides, muchos son translúcidos y parecen esporas de mohos» (PASTEUR, 1862). 2.2.4. Contaminación en superficies La contaminación en superficies logra proceder a los mecanismos primarios, contaminación, sudoración y el ambiente del entorno donde labora. Desde tiempos de la antigüedad, surgieron enfermedades que influían con la salud de la población de seres humanos que directamente se trasmitía por la superficie contaminada. (FU et al., 2007). La trasmisión de enfermedades por ocasión de la contaminación de la superficie contaminada de agente infeccioso hacia un huésped susceptible. De las cuales el índice de contraer la infección de las enfermedades tiene mayores probabilidades a ser contagiados. 2.2.4.1. Microorganismos presentes en superficies (WEATHERILL, 2008). La minoría de agentes patógenos se encuentra en zonas donde no procede con una buena limpieza por difícil acceso. Las zonas donde es el difícil acceso son: ángulos, soldaduras discontinuas, grietas hay mayor probabilidad para la formación de los microrganismo. 2.2.5. Microorganismos CRUZ (1989), dice, hoy en día hay varios tipos de microorganismos: mohos, levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas y virus; PASTOR (2010), manifiesta que estos han logrado desarrollar una capacidad singular de sobrevivir que permite que colonicen casi cualquier área 9 natural en la tierra, los microorganismos en grandes cantidades es superior en zonas de mayor población según DE LA ROSA et al. (2002). 2.3. Mecanismos de contaminación en ambientes internos 2.3.1. Contaminantes físicos (VAQUERO DE LA HOZ, 2011) Alteran la calidad de sus componentes aquellos que contaminan en parte física el ambiente, es decir son diferentes formas de energía que puede producir alteraciones en el ambiente y afectar a la salud. La contaminación a la superficie de la tierra por radioactividad artificial o natural. Así como los Rayos solares, radiaciones ionizantes, el ruido, vibraciones, temperatura, presión, etc. 2.3.2. Contaminantes químicos (VAQUERO DE LA HOZ, 2011) Son alteraciones del estado natural en materia inerte, inorgánica u orgánica, sintética o natural (nieblas gases, humos, polvo, vapores). De la cual afectan a seres vivos por las sustancias que modifican la composición química de los componentes del medio ambiente. 2.3.3. Contaminantes Biológicos (PELCAZAR, 1993). Son seres vivos contaminantes que alteran un determinado ciclo de vida y destruyen el entorno del ambiente. Es decir, causan enfermedades de prototipo parasitario e infeccioso. 2.4. Factores que intervienen en el crecimiento microbiano El ciclo de vida de los microrganismos, es parecido al de los seres vivos, por lo que es necesario el aporte de nutrientes y otros factores el cual varía para cada organismo. En la reproducción de los microorganismos intervienen 10 dos factores: factor intrínseco donde influyen las singularidad de la sustancia nutritiva; ya que (LLOP et al., 2002). Otro factor influyente es el de la particularidad propia de los microorganismos, el cual determina el medio favorable para el desarrollo de bacterias, virus y hongos, de la cual los diferentes tipos de alimentación contamina, los resultados se mostraran en el ser humano. El pH es para medir el grado de alcalinidad o acidez de un alimento que determinan la producción de algunos organismos las cuales mencionamos: aminoácidos, vitaminas y los azúcares, las que favorecen a levaduras y bacterias. (LLOP et al., 2002). (SENAMHI, 2008) Los métodos a realizarse para de disminuir la humedad de los alimentos adicionar azúcar, el secado. La humedad es un elemento hídrico, es una de las principales causas de contaminación alimenticia donde incrementa en grandes cantidades la propagación del microorganismo. Las técnicas utilizadas en las industrias alimenticias para bajar los niveles de oxígeno disponibles para el incremento de contaminación la que influye en la presencia de microorganismos, es la técnica al vacío. La colectividad de gérmenes que afectan a los seres humanos su crecimiento es de los 37º C, que es la temperatura normal del cuerpo humano, ya que nos provocan enfermedades que producen en nuestro organismo. Las temperaturas que oscilan mayor igual de 15ºC, se denomina microorganismo psicrófilos, Las temperaturas que oscilan mayor igual de 20 a 40ºC, se denomina microorganismo mesófilos, Las temperaturas que oscilan mayor igual de 20 a 11 30ºC, se denomina microorganismo psicotrópicos, Las temperaturas que oscilan mayor igual de 40 a 65ºC, se denomina microorganismo termófilo. En las cuales cuando las temperaturas bajas el microrganismos se mantiene inactivo (MISHALSKI, 1985). 2.4.1. Bacterias Son los causantes de varias enfermedades que sobreviven en medio adecuado, tiene facilidad de producir esporas sin un huésped. En contacto de un medio ambiente adecuado resiste a temperaturas y viven durante años sin alimento y poca agua, y se activa cuando encuentra un ambiente considerado para su desarrollo (PASTOR, 2010). Según la investigación realizada en la ciudad de Marsella, la cantidad de bacteria aumenta con la velocidad de viento y temperatura. (ROJAS et al., 2010). 2.4.1.1. Enterobacter Para MANDELL et al. (2006), los microorganismos que se encuentran dentro de este género no siempre causan daños en huéspedes sanos. E. sakazakil, E. aerogenes y E. cloacae, es la principal especie de Enterobacter siendo las causante de infecciones por este género. 2.4.1.2. Serratia Según MANDELL et al. (2006), la especie S. marcescens, se presenta mayormente como infección en personas y S. liquefaciens se desarrolla de manera eventual. Se encuentra en el ambiente, las infecciones se contraen de manera exógena. Así mismo, persiste en condiciones adversas, hasta en una 12 diversidad de desinfectantes, el cual se encuentra frecuentemente en el sistema respiratorio y laceraciones. Su difusión hematógena ocasiona algunos casos de osteomielitis, artritis bacteriana, otras; así mismo la meningitis puede producirse tras tratamientos neurológicos. 2.4.1.3. Proteus Cocobacilos, gramnegativos, aerobios, pueden presentar pleomorfismo. Desarrollan confluentemente, formando las llamadas “oleadas” sobre la superficie de los medios sólidos (agares). Se hallan presentes en el tracto intestinal humano y animal. Pueden contaminar vegetales con tallo corto, hortalizas, productos cárnicos y alimentos guardados a temperaturas medias (PASCUAL Y CALDERON, 2000). 2.4.1.4. Staphylococcus Las esféricas células de grampositivas están constituidas como racimos de uvas. Se reproducen rápidamente con una actividad metabólica constante, producen pigmentos y fermentan carbohidratos que cambian de amarillo a blanco. Hay microbianos que son normales en el ser humano y está en cómo huésped en mucosa la piel; El prototipo de inoculación alimenticio es normal enterotoxina estafilocócica termoestable. Los estafilococos desarrollan con rapidez resistencia a muchos antimicrobianos y pueden plantear problemas terapéuticos difíciles. (BARTRAM, 2003). 2.4.2. Fungi (Hongos) Según BOVALLIUS et al. (1978), los hongos son característicamente numerosos en verano, en tanto las bacterias se proliferan en 13 otoño y primavera, debido a los agentes de exposición de la luz solar, humedad relativa del aires, y la temperatura influyen en ella. PASCUAL y CALDERON, (2000) manifiestan que existen hongos que afectan a la salud; las levaduras como Blastomyces dermatiditis, Ceyptococcus neoformas, Candida albicans, etc.son frecuentemente infectiva; así mismo los hongos poseen la aptitud de generar toxinas naturales (Penicillum sp, Fusarium sp, Aspergillus sp, etc.). Sin embargo, algunos hongos influyen como aquellos que están involucrados en toxicidad de ello (p. ej., Aspergillus fumigatus). 2.4.2.1. Aspergillus Según SORIANO (2007), las especies de este género son generalmente ubicuas, las cuales pueden aislarse de diversos sustratos, frecuentemente en zonas de alta temperatura. Estos organismos de este crecen de manera acelerada presentando pigmentaciones: marrón – amarillo, negruzco, marrón – negruzco o verdoso, blanquecino. 2.4.2.2. Fusarium Para JAWETZ (2010), reconocer las especies de este género, son limitadamente diferentes Agar Papa Dextrosa (PDA). Se usa para aislar los hongos, Se utiliza una solución con nutrientes como Para determinar el ataque de este patógeno en las espigas, se observan diversas pigmentaciones las cuales pueden ser blancas – rosado y llegar a un tono anaranjado. Según SORIANO (2007), se realizaron estudios en los que se relacionó el consumo de maíz contaminado por Fusarium. 14 2.4.2.3. Geotrichum Según ROMERO (2007), este género de fungí produce Geotricosis, que es una micosis oportunista que ataca a la epidermis y los tejidos orgánicos suaves y húmedos del ser humano. Dicha infección puede ser endógena o exógena, con afecciones pulmonares, sistematizadas como la tuberculosis. Las afecciones cutáneas producen lesiones nodulares cuyo tratamiento se realiza con violeta de genciana y yoduro de potasio. 2.5. Elementos climáticos que actúan en el proceso de los microorganismos Según GREGORY (1973), las situaciones donde se presenta los estados químicos y físicos atmosféricos no presta garantía para el ciclo de vida del microorganismos de la mayor parte de las cual algunos sobreviven en un lapso corto de vida. Algún microorganismo sobrevive en fase de esporas en situaciones baja de metabolismo por las cuales no necesitan mayores cantidades de nutriente ni agua y tienen paredes gruesas donde son fuertes a los rayos solares. Algunas tienen forma aerodinámica de la cual son muy ligeras en su entorno espacial. El período de permanencia del microorganismo en el espacio acata al peso, tamaño, forma del microorganismo y la presencia de la intensidad del aire e vientos que someten al sostenimiento en el espacio. Son inconvenientes, que arrastran al suelo a las partículas suspendidas. Las esporas se producen en cantidades prominentes, las cuales aunque mueran en la atmosfera, su dispersión asegura la supervivencia de los microrganismos. La diversidad metabólica y estructural de los microorganismos hace que su supervivencia sea 15 variable. Las bacterias Gram negativas ya que su pared celular es más gruesa y Gram positivas son más tolerantes. Por ejemplo, Staphylococcus aureus. Responsable de abscesos, dermatitis, infecciones localizadas y posibles gastroenteritis (Gram positivo) y Salmonella typhi. Bacteria comprometida con el mal conocida como fiebre tifoidea, se traspasa por vía fecal-oral: contaminación de aguas, mala disposición de excretas o higiene defectuosa (Gram negativo) (DE LA ROSA et al. 2002). Los componentes fundamentales conforman parte de los microorganismos con la temperatura, la humedad relativa, materia orgánica y el oxígeno (POTTS, 1994). 2.5.1. Humedad relativa Según LIDWELL (1990), menciona que al disminuir la humedad relativa, disminuye la disponibilidad de agua para los microorganismos, causando deshidratación e inactividad de estos. Durante el secado causan perdidas fácilmente de las bajas capas atmosféricas. Según se incrementa la altitud, las circunstancias son convenientes para la evaporación ya que las esporas se desarrollan en los hidrometeoros. El desarrollo fúngico limita su crecimiento cuando esta es menor que 65% de humedad relativa. Para el desarrollo de bacterias estas requieren mayor humedad. 2.5.2. Temperatura La humedad relativa en base a la temperatura está relacionado, lo que hace muy dificultoso separar la reacción de ambos. La troposfera cerca de la superficie, a -80° C y varía de 40° C, en las capas altas y que la variabilidad 16 de los microorganismos disminuye según varios estudios ante el aumento de la temperatura Según MOHR (1997), CEPIS (1987). Pendiente alto, índice de incremento de microorganismos, se menciona los siguientes: psicrófilos, mesófilos y Termófilos: Los psicrófilos desarrollan con temperaturas (10 – 20 °C) los mesófilos tienen tiene mejor condiciones en temperatura 20 y 45 °C; debido a que la temperatura del cuerpo humano es de 37 °C donde involucran en las enfermedades a los seres humanos. Los termófilos presentan su óptimo crecimiento a temperaturas elevadas (45 – 55 °C). 2.5.3. Oxígeno Según MOHR (1997), es la relación de desaprobación entre la agrupación de viabilidad y oxígeno, que desarrollan deshidratación a la exposición. De las cuales se inactivan cuando no hay oxígenos. 2.5.4. Materia orgánica Según MOHR (1997), insuficiente agrupación de compuesto orgánico en la atmosfera, limita el crecimiento heterótrofo. Por lo que la escasez de agua limita el crecimiento de microorganismos autótrofos. 2.6. Patogenicidad de los microorganismos MONTAÑO et al. (2010), mencionan que las bacterias, protozoarios y virus, afectan a la salud humana. Se manifiestan que incremento de contagio a seres vivos trasfieren por microorganismos encontrándose en el espacio ambiental y producen enfermedades, exclusivamente, sistema respiratorio. Una ser humano puede 17 exhalar una media de 500 partículas al toser y de 1 800 a 20 000 en un estornudando, la pare media son menores de 10 µm (DE LA ROSA et al. 2002). La mucosidad y la garganta son diseminadas por el carraspeo, los estornudos y el dialogo logrando obtener una velocidad de 300 Km/h se denomina Los microorganismos causales por enfermedades. 2.7. Grado de contaminación microbiana ambiental Según ARENAS (2003), para estimar el grado de contaminación del aire por fungi, su concentración debe ser menor de 500 UFC/m3 para que el ambiente sea adecuado, mientras que para las bacterias una concentración mayor a 1000 UFC/m3 se considera al lugar como contaminado y por encima de los 1500 UFC/m3 el ambiente se clasifica como altamente contaminado. 2.8. Comedor Es un espacio designado para el consumo de alimentos por personas en horarios establecidos como desayuno, almuerzo, refrigerio. En un lugar puede haber varios ambientes destinados a esta labor. El servicio y el producto ofrecido en estos ambientes cambia su terminología en: cafetería, restaurant. El espacio designado tiene una cercanidad con el ambiente del procesamiento de los alimentos, para que durante la atención estos productos estén de fácil acceso a los huéspedes. De las cuales para ahorra espacio comedor y cocina se encuentra juntos (RAMO TRAVER, 1995). La Universidad Nacional Agraria de la Selva inicio sus actividades académicas en el año de 1965, en dicho año también se dieron inicio al funcionamiento del comedor. En la actualidad el comedor atiende a un promedio 18 de 1066.5 alumnos por semestre (983 alumnos en el ciclo 2019 – I y 1150 en el ciclo 2019 – II) 19 III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Lugar de ejecución 3.1.1. Ubicación política El presente trabajo de investigación se realizó en la sala de mesas y cocina del comedor, se procesaron las muestras en el Laboratorio de Microbiología General de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, ubicado políticamente en: Distrito : Rupa-Rupa Provincia : Leoncio Prado Departamento : Huánuco 3.1.2. Ubicación geográfica Geográficamente la ciudad de Tingo María está ubicado en las coordenadas latitud 09° 18ʹ 00ʹʹ longitud 76° 01ʹ 00ʹʹ a una altitud de 660 m.s.n.m., el comedor se encuentra localizado en las coordenadas UTM (E: 390283M y N: 8970638M) y el Laboratorio de Microbiología general en las coordenadas UTM (E: 390533M y N: 8970291m) a una altitud de 668 m.s.n.m. dentro del empalme Tingo María hoja 19-k de la Carta Nacional del Instituto Geográfico Nacional – Región Selva. 20 Figura 1. Mapa del comedor y L.M.G. 3.1.3. Aspectos ambientales Ecológicamente de acuerdo a la clasificación de zonas de vida o formaciones vegetales del mundo y el diagrama bioclimático de HOLDRIDGE (1987), Tingo María está en la formación vegetal bosque muy húmedo Pre- montano Tropical (bmh-PT), y de acuerdo a las regiones naturales del Perú corresponde a Rupa-Rupa o Selva Alta. Su altitud se encuentra dentro de los 650 y 1,200 m.s.n.m., con precipitaciones que exceden los 3,360 mm. En épocas de invierno. La temperatura media anual es de 22° y 25°C; la máxima 21 temperatura absoluta es de 33°C y 15°C es la mínima, datos obtenidos por la Estación Meteorológica José Abelardo Quiñones-Tingo María. 3.2. Materiales Se usaron variedad de materiales como: algodón, agitadores, ansa micológica, cubre objetos, asa de siembra, espátulas, embudo, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, gradillas para tubos de ensayo, hisopos estériles, mechero de Bunsen, placas Petri, termómetro digital, papel mantequilla, pipetas, pinzas, porta objetos, varillas de vidrio, vaso precipitado, etc. Así mismo, los medios de cultivo necesarios para la determinación de los microorganismos y su respetivo identificación son: Agar Eosina Azul de Metileno (EMB), Brain Heart Broth (BHI), Agar Cistina-Lactosa Deficiente en Electrolitos (CLED), Agar Mac Conkey, Agar Staphylococcus 110, Agar Cetrimide, Agar Sabouraud glucosa al 4%, Caldo peptona, Agar PlateCount. 3.2.1. Medios de cultivos para pruebas bioquímicas Los medios de cultivo usados para las muestras bioquímicas son: Agar hierro - triple azúcar (TSI), Caldo peptona 0.1%, Agar lisina hierro (LIA), Caldo rojo de metilo y Voges-Proskauer (RMVP), Agar citrato de Simmons, Agar urea, Caldo Malonato. 3.2.2. Reactivos Los reactivos empleados fueron: Rojo de metilo, Azul lactofenol- glicerol, Reactivos de Indol según Kovacs, Alfa Naftol, Hidróxido de sodio al 4% (NaOH). 22 3.2.3. Equipos Los equipos que se usaron son: Autoclave, Baño maría, Balanza, Cabina de bioseguridad, Contador de colonias, Estufas, Microscopio, Cámara fotográfica digital. 3.3. Métodos 3.3.1. Tipo de investigación El presente trabajo es de tipo experimental. 3.3.2. Variables dependientes Entre las variables dependientes tenemos: Grado de contaminación, aire y superficies contaminados del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva 3.3.3. Variables independientes Tenemos: Concentración de microorganismos (bacterias y fungi) del aire y superficie en la sala y cocina del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. 3.3.4. Diseño experimental 3.3.4.1. Unidades experimentales La unidad en estudio es el grado de contaminación microbiológica en el aire y superficies en 3 puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. 23 Figura 2. Flujograma Toma de muestras en el comedor Traslado de muestras al L.M.G. para su procesamiento Preparado de Agar BHI y medios de cultivo Muestras de muestras de aire superficie Bacterias Fungi Bacterias Fungi Reconocimiento de hongos y bacterias por microscopio Se hizo la repetición 1 y 2 de todo el proceso, para la obtención y posterior procesamiento de los resultados. 24 3.3.5. Reconocimiento del área de estudio Se realizaron las visitas respectivas de reconocimiento del área de estudio y así se estableció los puntos de muestreo en el comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Figura 3. Plano de las áreas del comedor (elaboración propia). 3.3.6. Muestreos Se realizó tres 3 repeticiones, la primera repetición se realizó en el mes de Junio del año 2019; La segunda repetición se realizó en el mes de Agosto del año 2019 y la tercera repetición se realizó en el mes de Octubre del año 2019. Para la recolección de datos se escogió 3 puntos de muestreo, los que fueron: Punto 1 (entrada del comedor), Punto 2 (centro del patio del comedor) y Punto 3 25 (cocina del comedor). Todos los muestreos se realizaron a la 1 pm, durante el funcionamiento de comedor. 3.3.6.1. Toma de muestras de aire La toma de la muestras de aire se realizó mediante el método volumétrico. Se lleva una caja hermética y dentro de ella nuestros matraces con el caldo BHI, en cada punto de muestreo se realizó 50 aspiraciones de aire. Con una jeringa de 60 mL previamente esterilizada descartable se realizaron aspiraciones. El contenido de la jeringa de cada aspiración se descargó en un matraz con el caldo BHI para bacterias y para fungí en un matraz con BHI más antibiótico (LOPEZ, 2004). 3.3.6.2. Toma de muestras en superficie Para obtención de las muestras en superficie, se utilizó el método del hisopado. Para este método de la misma forma, se llevó en una caja hermética los matraces con el caldo BHI, luego se tomó una mesa del comedor en cada punto de muestreo, se colocó un perímetro de 25 cm2 y con un hisopo se procedió a frotar los cuadrantes más pequeños, de 1 a 2 pasadas. Luego se sumerge el hisopo en el matraz con caldo BHI para bacterias y en caldo BHI mas antibiótico (Ceftriaxona) para fungí (LOPEZ, 2004). 3.3.7. Preparación de BHI para muestreo Se preparó 6 matraces con Brain Heart Broth (BHI) mediante el siguiente procedimiento: se adicionó 3.7g de Brain Heart Broth (BHI) granulado en 100 mL de agua destilada; se procedió a repartir en envases con medidas para el muestreo de bacterias, para el muestreo de hongos se agregó 1g de antibiótico (Ceftriaxona) para inhibir el desarrollo de bacterias. 26 3.3.8. Determinación de bacterias del aire Para el desarrollo de bacterias, en matraces con medio Brain Heart Broth (BHI) se pusieron a incubar a una temperatura de 37ºC por un lapso de tiempo de 48 horas, una vez transcurrido este tiempo se retiró un inóculo con un asa de siembra y se sembró por estrías en placas Petri con medios enriquecedores (Agar Manitol Salado, Agar CLED, Agar Mac Conkey, Agar M77, Agar Sabouraud), se llevaron a incubar a una temperatura de 37°C por 24 horas. Luego se pasó a realizar las pruebas bioquímicas, donde se utilizó diferentes pruebas, como: Caldo Malonato Indol, Voges Proskauer, , Rojo de Metilo, Urea, TRI, Citrato de Simmons, LIA, y Sim. Posteriormente se realizó la coloración diferencial según GRAM. Para luego pasar a observar las muestras obtenidas al microscopio. 3.3.9. Determinación de fungí del aire Los matraces con el antibiótico (Ceftriaxona), más el caldo BHI y más la muestra se llevó a incubar a temperatura ambiente por un tiempo de 3 a 5 días, una vez transcurrido esos días se retiró un inóculo de cada caldo BHI y se sembró en Agar Sabouraud. Se incubó las placas por 5 días a temperatura ambiente para poder realizar el microcultivo, los cuales se incubaron también durante 5 días para finalmente, poder observar los montajes preparados del microcultivo al microscopio y mediante la guía de BARNETT (1960) lograr determinar los géneros. 27 3.3.10. Recuento de microorganismos Para realizar el recuento microbiano se preparó caldo peptona, el cual fue vertido 90 ml por matraz, se utilizaron seis matraces en los que se adicionaron siguiendo el método de dilución 10 ml (10-1) de cada frasco con BHI (después de 48 horas de incubación), se homogenizó y se realizó dos diluciones más, se extrajo 1 mL de la muestra y se adiciono a un tubo de ensayo con 9 mL de Caldo peptona (10-2), se homogenizó y se repitió el procedimiento (10-3), de ésta última dilución, se realizó el método de placa vertida, para el cual se extrajo 1 mL de la última dilución y dicha solución es vertida sobre una placa Petri vacía y esterilizada agregando 10 mL de agar Plate Count, se dejó solidificar por unos 10 minutos y se llevó las placas a la estufa a 37°C por 48 horas. Pasado este tiempo se realizó el conteo de microorganismos con ayuda del contador de colonias manual. La fórmula para el conteo de microorganismos (m.o.) es la siguiente: “m.o./cm3 de aire = Número de colonias × Inóculo de siembra × Factor de dilución” 28 Figura 4. Cálculo del número de microorganismos por el método de diluciones seriadas. 3.3.11. Preparación de medios de enriquecimiento Se hizo uso de los agares para el aislamiento de bacterias y se preparó de la siguiente manera (LOPEZ, 2004):  Agar Manitol Salado: Se agregó 33.3 gr de agar en agua destilada 300 mL.  Agar CLED: Se diluyo 10.9 gr de agar CLED en 300 mL de agua destilada.  Agar Mac Conkey: En agua destilada 300 mL se agregó 15 gr del agar.  Agar M77: En 300 mL de agua destilada se añadió 1.5 gr de peptona, 0.15 gr de K2HPO4, 0.06 gr de MgSO4.7H2O, 0.06 gr de NaCl, MnSO4 trazas, FeCl3.6H2O trazas, 4.5 gr de manitol salado, 1.5 gr de extracto de levadura y 7.5 gr de Agar Agar. 29 Para el desarrollo y aislamiento de hongos se utilizó:  Agar glucosa 4% según Sabouraud: En 300 mL de agua destilada con 19.5 g del agar. Todos los matraces se mezclaron de manera homogénea para luego ser llevados a baño maría, después se los llevó a autoclave para el proceso de esterilización a 15 Lb de presión por 15 min a una temperatura de 121 °C, se dejó enfriar hasta 45ºC para luego proceder a plaquear (LÓPEZ, 2004). 3.3.12. Cultivo en medios enriquecedores Los matraces que contenían BHI con muestras de aire que se incubaron a 37ºC por 48 horas se retiró un inóculo con un asa de siembra, para ser sembrado en las placas Petri. Se sembró con el método de estrías en placas en superficies. Estas placas Petri fueron llevadas a una temperatura de 37ºC por 48 horas a incubación. La siembra de hongos, del caldo BHI más antibiótico se retiró un inóculo y se sembró en agar sabouraud por el método de puntura para los 3 muestreos. Se incubarán las placas por un tiempo de 5 a 8 días a temperatura ambiente. 3.3.13. Pruebas de diferenciación bioquímica Se utilizó una batería de pruebas químicas, para identificación de bacterias constituida por las siguientes pruebas: caldo Malonato, rojo de metilo, Indol, urea, citrato de Simmons, Voges-Proskauer, LIA, TSI. 30 Después de haber incubado las placas Petri para el crecimiento de bacterias, se realizó las pruebas para identificar las bacterias en los medios de diferenciación bioquímica, en tubos de capacidad de 5ml: a. Indol Se vertió 9 mL aproximadamente de caldo peptona al 0.1% a un tubo de ensayo, se realizó la siembra de bacterias con el ansa de siembra por el método de enjuague. Se incubó por 48 horas, para la determinación del Indol se adiciona el reactivo de Kovacs, de 2 – 3 gotas. Si hay presencia de anillo rojo el Indol será positivo (+), si no hay reacción del Indol será negativo. b. Rojo de metilo Se utilizó el caldo rojo de metilo y Voges-proskauer (RMVP), aproximadamente 9 mL en cada tubo de ensayo, se sembró mediante el método de enjuague; se incubó por 48 horas y como reactivo se adiciona el rojo de metilo de 2 -3 gotas. Si hay fermentación de la glucosa el medio vira a rojo. c. Voges-Proskauer Se vertió en el tubo de ensayo el caldo RMVP, se sembró mediante el método de enjuague y se incubó por 48 horas; como reactivo, se utilizó hidróxido de sodio (NaOH) al 4% de 2 - 3 gotas y se adicionó el reactivo de alfa naftol de 2 – 3 gotas. Si el medio vira a color rosado opaco se dice que es VP+. d. TSI Se vertió el agar a 45°C hasta la tercera parte de los tubos de ensayo, se dejó enfriar en pico de flauta, luego se sembró en puntura y estrías, 31 se incubó a 37°C por 48 horas; el tipo de reacción positivo o negativo se conoce por el cambio de color y degradación de los azucares. e. LIA Se vertió el agar a los tubos de ensayo a una temperatura de 45 º C y se dejó enfriar en pico de flauta, para proceder a sembrar la colonia de bacteria seleccionada mediante el método de puntura y estrías; la reacción se muestra mediante el cambio de color. f. Citrato de Simmons Se vertió el agar en los tubos de ensayo y se dejó enfriar en modo inclinado para luego sembrar por el método de estrías. Pasada las 48 horas de incubación, el cambio a color azul indica reacción positiva y aumento de pH. g. Caldo Malonato Se vertió el caldo en los tubos de ensayo y se realizó la siembra por el método de enjuague, después de incubar por 48 horas se observó si hubo o no reacción, es positivo si cambia a color azul, esto ocurre por el consumo de Malonato de sodio. h. Urea Se distribuyó el agar en tubos de ensayo, se sembró las colonias de bacterias por el método de puntura, al cabo de las 48 horas el cambio de color nos mostró si hubo reacción positiva. Para las pruebas de citrato TSI, LIA, Urea, se observó un viraje de color de cada prueba, con la ayuda de una tabla de pruebas bioquímicas se observó la especie o genero de cada microorganismo. 32 - TSI: Degradación de los tres azucares (Lactosa, Glucosa y Sacarosa). K: Alcalino A: Acido K/A: La bacteria ha degradado sacarosa y glucosa. A/A: La bacteria ha consumido los tres azucares + H2S + gas. A/K: Bacterias anaerobias. R/K: No hay reacción. - Prueba de LIA (Lisina descarboxilasa): se observó la desanimación descarboxilación. K: Alcalino A: Acido K/K: No reacción K/A: Diseminación de lisina A/K: Diseminación de lisina. A/A: Diseminación de lisina + H2S + gas 3.3.14. Coloración de bacterias Se tomó una pequeña muestra de la cepa y se puso en el portaobjetos por medio de frotis. Posteriormente se fijó la muestra al portaobjeto haciendo uso de un mechero, pasando el portaobjeto por encima de la flama (para que se seque) y enfriando inmediatamente el portaobjeto para no quemar la muestra (LOPEZ, 2004). - Se colocó el portaobjeto sobre un soporte que consta de 2 varillas, luego se agregó de 1 a 2 gotas de cristal violeta al portaobjeto, se esperó de 1.5 a 2 minutos y se enjuago a chorro. 33 - Acto seguido, se agregó de 1 a 2 gotas de Lugol a la muestra que se encuentra en el portaobjeto por un tiempo de 1.5 a 2 minutos, luego se enjuago a chorro. - Luego se añadió Alcohol acetona y por 5 segundo se realizó movimientos de vaivén, después de este tiempo se enjuago a chorro. - Inmediatamente después se agregó de 1 a 2 gotas de Safranina, por un tiempo de 30 segundos, se lavó a chorro y se dejó secar. - Una vez seco, se agregó de 1 a 2 gotas de aceite de inmersión y se procede a observar en el microscopio con un objetivo de 100X. 3.3.15. Microcultivo fúngico Se esterilizó las placas Petri conteniendo: un soporte de vidrio en forma de herradura, un porta y un cubre objeto. Se preparó una placa Petri con medio agar de Sabouraud glucosa 4%, dividido en cubitos de aproximadamente 20 × 20 × 10 mm. Cada cubito se colocó sobre el porta objeto dentro de la placa de microcultivo y sobre la varilla de vidrio. De los cultivos aislados de fungi se eligió diferentes tipos de colonias por cada placa de microcultivo. Una vez elegida la colonia de fungi, con la ayuda de un ansa micológica, se tomó un inóculo de la misma y se trasladó sobre el cubito de medio de sabouraud que se colocó sobre el porta objeto dentro de la placa de microcultivo. Se colocó el cubre sobre el cubito de agar, luego se puso dentro de la placa un algodón húmedo para asegurar la humedad y el crecimiento del hongo. La placa de microcultivo se llevó a incubación a temperatura ambiente por un tiempo de 5 – 7 días. 34 Al término de la incubación, se retiró suavemente con ayuda de una pinza el cubre objeto de la placa de microcultivo y se colocó sobre un porta objeto limpio y desengrasado al que ha colocado previamente 1 – 2 gotas de azul de lacto glicerol. Con la ayuda de papel secante, se absorbió el exceso de colorante. Se selló los lados laterales con esmalte de uñas transparente. Se eliminó el cubito de medio sabouraud llevándolo a un recipiente conteniendo lejía diluida al 10 %, se retiró el porta de la placa de microcultivo y se agregó de 1 – 2 gotas de azul lacto glicerol. Se añadió un cubreobjetos limpio y desengrasado. Con papel secante, se absorbió el exceso de colorante. Se selló los lados laterales con esmalte de uñas transparente. Las muestras obtenidas, se observan al microscopio utilizando un lente ocular de 10x y un lente objetivo de 40x, así el aumento total será de 10x40 = 400 aumentos. 3.3.16. Reconocimiento de riesgos potenciales para la salud Se utilizó la información de la Organización Panamericana de la Salud (OPS, 2009). Del cual se pudo conocer y recopilar los datos necesarios de las bacterias y fungi encontrados en los análisis del presente trabajo de investigación. 35 IV. RESULTADOS 4.1. Bacterias y fungi del aire interno y en diferentes superficies del comedor. 4.1.1. Microorganismos a partir del aire En el cuadro 1 se aprecia el número de microorganismos (UFC/cm3) encontrados en el aire de los 3 puntos de muestreo dentro del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, siendo el promedio mayor en el punto 1 (entrada del comedor) con 338x 103 UFC/cm3 de aire. Cuadro 1. Número de microorganismos UFC/cm3 de aire en los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Zona de muestreo 1° Muestreo (UFC/cm3 de aire) 2° Muestreo (UFC/cm3 de aire) 3° Muestreo (UFC/cm3 de aire) Promedio por zona Promedio total Entrada de comedor 381x 103 193x 103 242x 103 272x 103 patio del comedor 185x 103 66x 103 173x 103 141x 103 140x 103 Cocina de comedor - 18x 103 25x 103 14x 103 Promedio por muestreo 189x 103 92x 103 146x 103 142x 103 36 En la figura 5 se observa la unidad porcentual de número UFC/cm3 de aire en los puntos de recolección de muestras. El mayor porcentaje de UFC bacteria/cm3 de aire se registró en la entrada del comedor con un 63% (272x 103 UFC/cm3) y el valor mínimo se registró en la cocina del comedor con 4% (16x 103 UFC/cm3). Figura 5. Cantidad porcentual de organismos en el aire. 4.1.2. Microorganismos a partir de superficies El cuadro 2 se muestra el valor máximo de UFC/cm2 promedio de microorganismos es de 147x 102 UFC/cm2 en el punto 1 (entrada del comedor), y el menor valor de UFC/cm2 promedio de microorganismos es de 59x 10cm2 UFC/cm2 en el comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. 63% 33% 4% Punto 1: Entrada del comedor Punto 2: Centro del patio del comedor Punto 3: Cocina del comedor 37 Cuadro 2. Número de microorganismos UFC/cm2 de superficie en los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Zona de muestreo 1er muestreo (UFC/cm2) 2do muestreo (UFC/cm2) 3er muestreo (UFC/cm2) Promedio por zona Promedio total Entrada del comedor 161x 102 128x 102 152x 102 147x 102 Centro del patio del comedor 158x 102 106x 102 92x 102 119x 102 108x 102 Cocina del comedor 76x 102 39x 102 63x 102 59x 102 Promedio por muestreo 131x 102 91x 102 102x 102 108x 102 En la figura 5 se observa la cantidad porcentual de número de unidades formadoras de colonias por centímetro cuadrado de superficie de los puntos de muestreo. El mayor porcentaje de UFC de bacterias/cm2 se registró en el punto 1 (entrada al comedor) con 45% (147x 102 UFC/cm2) y el valor mínimo se registró en el punto 3 (cocina del comedor) con 18% (59x 102 UFC/cm2). 38 Figura 6. Cantidad porcentual de organismos en superficies. 4.2. Identificación de bacterias 4.2.1. Bacterias encontradas a partir del aire En el cuadro 3 se observa los valores de las especies de bacterias en el aire de los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. El valor máximo de especies de bacterias en el aire se registró en el punto 1 (entrada del comedor) con una sumatoria de 5 y el valor mínimo se registró en el punto 3 (cocina del comedor) con una sumatoria de 1 especie bacteriana. 45% 37% 18% Punto 1. Entrada del comedor Punto 2. Centro del patio de comedor Punto 3. Cocina del comedor 39 Cuadro 3. Cuadro resumen, bacterias presentes en el aire por punto de muestreo del comedor UNAS. Punto de muestreo Especies identificadas Total Punto 1 (entrada del comedor) Enterobacter agglomerans, Klebsella pneumoniae, Enterobacter hafnia, Proteus morganii, Serratia marcescens 5 Punto 2 (Centro del patio del comedor) Enterobacter agglomerans, Klebsella pneumoniae, Proteus morganii 3 Punto 3 (Cocina del comedor) Enterobacter agglomerans 1 4.2.2. Bacterias encontradas a partir de superficies En el cuadro 4 vemos las especies de bacterias encontradas en las superficies de los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva y sus respectivos valores. El número máximo de especies de bacterias en las superficies se registró en el punto 2 con una sumatoria de 5 y el valor mínimo se registró en el punto 3 (cocina del comedor) con una sumatoria de 1 especie bacteriana. 40 Cuadro 4. Cuadro resumen, bacterias presentes en la superficie por punto de muestreo del comedor UNAS. Punto de muestreo Especies identificadas Total Punto 1 (1era mesa de la entrada del comedor) Proteus morganii, Enterobacter sp. 2 Punto 2 (mesa del centro del comedor) Lactobacillus sp., Staphylococcus sp., Enterobacter sp, Klebsella pneumoniae, Enterobacter hafnia 5 Punto 3 (mesa de cocina del comedor) Enterobacter agglomerans 1 4.3. Identificación de fungí 4.3.1. A partir del aire En el cuadro 5 Se observa los valores de los géneros de fungi presentes en el ambiente de los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. El valor máximo de géneros fungi del aire se registró en el punto 2 (centro del comedor UNAS) con una sumatoria de 3 y el valor mínimo se registró en el punto 3 (cocina del comedor UNAS) con una sumatoria de 1 géneros de fungi. 41 Cuadro 5. Géneros de Fungí presentes en el aire por zona de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Puntos de muestreo Géneros identificados Total Punto 1. Entrada al comedor Geotrichum sp., Aspergillus sp. 2 Punto 2. Centro del patio del comedor Geotrichum sp., Fusarium sp., Aspergillus sp. 3 Punto 3. Cocina del comedor Geotrichum sp. 1 4.3.2. A partir de la superficie En el cuadro 6 Se observa los valores de los géneros de fungi presentes en la superficie de los puntos de muestreo del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. El valor máximo de géneros fungi del aire se registró en el punto 2 (centro del comedor UNAS) con una sumatoria de 3 y el valor mínimo se registró en el punto 1 (cocina del comedor UNAS) con una sumatoria de 1 géneros de fungi. 42 Cuadro 6. Géneros de Fungí presentes en la superficie por zona de muestreo en el comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Puntos de muestreo Géneros identificados Total Punto 1. Entrada al comedor Geotrichum sp. 1 Punto 2. Centro del patio del comedor Geotrichum sp., Fusarium sp., Arpergillus sp. 3 Punto 3. Cocina del comedor Geotrichum sp., Fusarium sp. 2 43 4.4. Riesgos potenciales a la salud por la presencia de microorganismos en el aire y superficie En el cuadro 7 Y 8 se enumera los principales riesgos potenciales de la presencia de microorganismos (bacterias y fungi) en el aire que pueden contaminar el ambiente del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Cuadro 7. Riesgos potenciales y tratamiento para bacterias encontrada. Bacteria encontrada Lugar Riesgos que ocasiona Tratamiento Enterobacter agglomerans Aire Infección del tracto urinario y tracto respiratorio Almacenamiento al 5°C o menos, evitar exponer a intemperie los alimentos fumigaciones periódicas Enterobacter hafniae Aire y Superficie Infección del tracto urinario y de tracto respiratorio Almacenamiento a 5°C o menos, evitar exponer a intemperie los alimentos, fumigaciones periódicas. Enterobacter sp Aire y Superficie Infección del tracto urinario y del tracto respiratorio, gastroenteritis aguda, peritonitis cuando existen infecciones intraabdominales, neumonía nosocomial. 44 Klebsielle pneumoniae Aire y Superficie Neumonía, infecciones del tracto urinario (ITU), la espondilitis anquilosante, septicemia e infecciones suaves del cuerpo en los seres humanos. Casi siempre, una infección de Klebsiella pneumoniae es muy común en pacientes con enfermedades como la diabetes, enfermedades pulmonares crónicas, los alcohólicos crómicos, etc. De hecho, es la segunda más patógeno virulento, al lado de E. coli, que causa infección del tracto urinario. Lactobacillus sp Superficie Existe una enorme diversidad de especies de lactobacilos. Estas son "bacterias amistosas" que viven normalmente en nuestros sistemas digestivo, urinario y genital sin causar enfermedades. El lactobacilo también se encuentra en alimentos como el yogur y en suplementos dietéticos. Serratia marcescens Aire Conjuntivitis, queratitis e infecciones en heridas, riñones y vías urinarias, así como infecciones respiratorias, meningitis y endocarditis. Esta bacteria afecta especialmente a pacientes hospitalizados y a pacientes que tienen la inmunidad disminuida por enfermedades sistémicas o tratamientos médicos inmunosupresores, infección cutánea. Para prevenir las infecciones de Serratia, se requiere ropa protectora y lavado de manos y la esterilización apropiada de instrumentos. Mantener un ambiente limpio en el baño es también importante. 45 Staphylococcus sp Superficie Microorganismos que están presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves, incluyendo un total de 51 especies, de las cuales 17 se pueden aislar del ser humanos. Los antibióticos que se recetan habitualmente comprenden ciertas cefalosporinas, nafcilina o antibióticos relacionados, como sulfamidas o vancomicina. Proteus morganii Aire y Superficie Infecciones urinarias, enteritis (especialmente en niños), abscesos hepáticos, meningitis, otitis media y neumonía con o sin empiema, entre otros. Es generalmente susceptible a muchos antibióticos como tetraciclinas. 46 Cuadro 8. Riesgos potenciales y tratamiento para fungi encontrados. Fungi encontrado Lugar Riesgos que ocasiona Tratamiento Aspergillus sp. Aire y superficie Hipersensibilidad, Mitocoxicosis, micosis sistémica, infección micosis (otomicosis, Onicomicosis, queratitis) y el aspergiloma. Efectos alérgicos (asma), efectos tóxicos, efectos cancerígenos por vía digestiva (cáncer de hígado). Desinfección (Fenólicos, yodóforos, glutaraldehido 2% y formaldehido, Hipoclorito sódico y sulfato de cobre), Antimicóticos (Itraconazol, anfotericina B, voriconazol y posaconazol). Disponer de ventilación adecuada en los lugares de trabajo, evitar la humedad relativa alta y las condensaciones, implantar un programa periódico de limpieza y mantenimiento de locales e instalaciones. Almacenar los productos de origen vegetal o animal: alimentos, residuos orgánicos, paja, madera, cereales, etc. Fusarium sp. Aire y superficie Mitocoxicosis, infecciones sistémicas en pacientes inmunocomprometidos con una alta mortalidad, peritonitis y diálisis peritoneal crónica ambulante, Onicomicosis. Geotrichum sp. Aire y superficie Geotricosis pulmonar, Geotricosis bronquial, Geotricosis bucal, Geotricosis vaginal, Geotricosis gastrointestinal. 47 V. DISCUSIÓN Las concentraciones de microorganismos en la atmosfera, hasta una altura de 3000 metros (Troposfera), oscilan entre 101 y 104 por metro cubico de aire (BOVALLIUS et al., 1987). Podemos confirmar esto en el cuadro 1, donde vemos una variación de datos UFC/cm3, el valor máximo de concentración encontrado es de 242x 103 UFC/cm3 y un mínimo valor de 0x 103 UFC/cm3, esto se registró en la entrada del comedor y en la cocina del comedor respectivamente. Cabe mencionar que la zona de la cocina es el punto de muestreo donde se registró los menores valores. Según LOPARDO et al., (2018), El género Enterobacter se encuentra como comensal en el medio ambiente en fórmulas alimentarias, en la piel y en el tracto intestinal de humanos y animales. Esto se confirma en el cuadro 3 y 4, por lo que este género (Enterobacter) es el que se encontró con mayor presencia en los puntos de muestreo y esto se puede deber a la presencia de humedad. Según BOVALLIUS et al. (1978), los hongos son característicamente numerosos en verano, en tanto hay mayor cantidad de bacterias en otoño como en primavera, puesto que la humedad relativa del aire, la exposición de luz solar y temperatura influyen en ella. Es así que se confirma los resultados del cuadro 3 y 4, donde se demuestra que hay mayor cantidad de bacterias (8) que de fungí (3), por haber tomado las muestras en un intervalo de tiempo, alrededor del mes de septiembre, mes en el cual se encuentra la estación de la primavera según el hemisferio en el que nos encontramos (véase cuadro 20). 48 Según GONZALES (2013), Método IMVIC, es una prueba utilizada en microbiología para la identificación de bacterias, se compone de cuatro (4) pruebas: Indol (I), Rojo de Metilo (RM), Voges Proskauer (VP) y Citrato Simons (SC). Mediante el resultado obtenido se afirma que el uso del método de IMVIC (ver cuadro 21) facilito el hallazgo de bacterias, tales como: Proteus morganii, Enterobacter agglomerans, Enterobacter hafniae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens. Según la OMS (2005), la lista de las bacterias patógenas para la salud humana más peligrosas del mundo e invulnerables a los antibióticos, en la que se incluyen a 12 familias de bacterias más peligrosas para la salud humana de la OMS, se divide en tres categorías: Prioridad critica, alta y media (OMS, 2005). Esto se confirma y se coloca a la calidad microbiológica del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva en el nivel alto, ya que la mayoría de las bacterias encontradas en el comedor no figuran en el nivel crítico, alto o medio, a excepción de Klebsiella y Proteus en el nivel crítico y del Staphylococcus en el nivel alto. Los microorganismos pueden dejar la atmósfera de distintas maneras, los microorganismos pueden sedimentar ocasionado por la gravedad, como también pueden ser lavados por lluvias u otro tipo de precipitación. BRICEÑO (2016), confirma esto al encontrar los mismos microorganismos tanto en aire como en alimentos. De lo antes mencionado, entonces esto reconfirmamos en los cuadros 3 y 4, se encontró Enterobacter agglomerans, Enterobacter hafniae, Proteus morganii y Klebsiella pneumoniae tanto en el aire como en superficie (GREGORY, 1973). Según ATLAS y BARTHA, (2002), casi todos los microorganismos no son capaces de soportar largos desplazamientos a través de la atmósfera (solo unos pocos milímetros), pero un número muy escaso de microorganismos logran resistir el transporte de distancias largas puesto que estos pierden viabilidad por culpa de la desecación, esto especialmente ocurre durante el día y en capas bajas, esto se confirma en los cuadros 3 y 5, en los cuales se 49 muestran la presencia de Enterobacter agglomerans (bacteria) y Geotrichum sp. (Fungi), en el aire de los 3 puntos de muestreo a las 13 horas. La duración de los microorganismos en el medio ambiente va a variar de acuerdo al tamaño del microorganismo, forma y peso también influyen, esto se confirma en los cuadros 4 y 6, donde vemos un buen número de bacterias y fungi sobre una superficie (DE LA ROSA et al., 2002). Según GONZALES (2013), para evaluar el grado de contaminación del aire por fungi, su concentración debe ser menor de 500 UFC/m3 para que el ambiente sea aceptable, esto se puede afirmar en el cuadro 1 y 2, fungi en el aire y fungi en superficies respectivamente, podemos decir que el grado de contaminación del comedor se puede considerar como MODERADO por tener valores mucho menor a los 500 UFC/m3. 50 VI. CONCLUSIONES Se registraron cuatro (4) géneros bacterianos en horario de almuerzo (1:00 pm): Enterobacter, Serratia, Klebsiella y Proteus. El mayor número de microorganismos aerobios se obtuvo en la entrada del comedor, y el mayor número de microorganismos en la superficie se halló en el Centro del patio del comedor. Las bacterianas encontradas en el interior del comedor fueron: Enterobacter agglomerans, Klebsella pneumoniae, Enterobacter hafnia, Proteus morganii, Serratia marcescens. Y en las superficies se detectaron: Lactobacillus sp., Staphylococcus sp., Enterobacter sp, Klebsella pneumoniae, Enterobacter hafnia, Proteus morganii. Los fungi encontrados en el aire fueron: Geotrichum sp, Aspergillus sp, Fusarium sp. Y en las superficies se encontraron los mismos géneros de fungi. La presencia de microorganismos patógenos en el aire interno y superficies del comedor indica una moderada calidad microbiana. 51 VII. RECOMENDACIONES Recomendar el ingreso de los estudiantes al comedor de manera adecuada y limpia, ya que en muchos casos estos vienen de trabajos de campo donde se encuentran con diferentes niveles de salubridad. Elaborar, implementar e inducir un protocolo de limpieza y desinfección del aire y superficies del interior del comedor de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, para garantizar a los usuarios un ambiente limpio, con la menor carga de contaminantes donde se minimicen los riesgos de transmisión de enfermedades. Realizar periódicamente muestreos del aire y en superficies del comedor para así poder contar con un mayor número de datos que nos dé a conocer el comportamiento de los microorganismos y poder asegurar la salud de los estudiantes y de los trabajadores administrativos. 52 ABSTRACT Through a microbiological analysis of the dining hall, the bacteria and fungi in the internal air and on the dining hall surfaces could be isolated. It was determined that the air and the surfaces within the dining hall at the Universidad Nacional Agraria de la Selva present microorganisms (bacteria and fungi). The analyses were for two (2) environmental components: air and surface, at three sampling points: P1 dining hall entrance, P2 center of the dining hall patio, P3 dining hall kitchen. The three samples were taken during the months of June, August and October, respectively, with 1:00 pm being the time that was chosen for the sampling. The contamination of the air from microorganisms was determined and identified in the dining hall, they were: Enterobacter agglomerans, Staphylococcus sp, where the Staphylococcus sp bacteria resulted as the most pathogenic. Through biochemical tests, five bacteria species were found in the air and seven bacteria species on the surfaces. Using the microculture test three species of fungi were found in the air and three species of fungi on the surfaces. Altogether, eight bacterial species were found within the dining hall, which were: Enterobacter agglomerans, Enterobacter hafnia, Enterobacter sp, Klebsiella pneumoniae, Proteus morganii, Serratia marcescens, Staphylococcus sp, Lactobacillus sp and three fungal species, which were: Geotrichum sp, Aspergillus sp and Fusarium sp. The potential health risks, due to the presence of the microorganisms (bacteria and fungi) found at the different points within the dining hall, were detected during the development of the present thesis work. The resulting quality is moderate. 53 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA AIRA, M.; JATO, V.; IGLESIAS, I. Y COL 2005. Calidad del aire: polen y esporas en la comunidad Gallega. Ed. Grafisant S.L. 237 Pg. ARENAS, R., 2003. Micología Médica ilustrada. 2ed. México: McGraw Hill Interamericana. ATLAS, R., y BARTHA, R. 2002: Ecología microbiana y Microbiología ambiental. Ed. Pearson Educación, Madrid. AULICIEMS, A. 1981. 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Pruebas bioquímicas Zona de muestreo / Medio P1/A P2/A P3/A P1/S P2/S P3/S INDOL + + - - + + SIM + + - - + - RM - - + + - + VP - + - - + - CITRATO - - + + - - TSI + + + + + + LIA - - - - + - MALONATO - + + + + + UREA + - + + - + Nombre de la Bacteria P. morganii P. morganii E. agglom. E. agglom. E. hafniae E. agglom.  P. morganii = Proteus morganii  E. agglom. = Enterobacter agglomerans  E. hafniae = Enterobacter hafniae 63 Cuadro 11. Bacterias identificadas en pruebas bioquímicas de la tercera repetición. Pruebas bioquímicas Zona de muestreo / Medio P1/A P2/A P3/A P1/S P2/S P3/S INDOL + - + + - - SIM + - - - - - RM - - + + + + VP + + - - - - CITRATO + + - - + - TSI + + + - + + LIA + + - - - - MALONATO - + + - + + UREA - + + + + + Nombre de la Bacteria Serr. marcescens K. pseumon. E. agglom. P. morganii E. agglom. E. agglom.  Serr. marcescens = Serratia marcescens  K. pseumon. = Klebsiella psuemoniae  E. agglom. = Enterobacter agglomerans  P. morganii = Proteus morganii 64 Cuadro 12. Promedios de UFC/cm3 en dilución 103 en aire. Zona de muestreo 1° 2° 3° Muestreo (UFC/cm3 de aire) Muestreo (UFC/cm3 de aire) Muestreo (UFC/cm3 de aire) Promedio por zona Promedio total Entrada de comedor 381 193 242 338 patio del comedor 185 66 173 141 165 Cocina de comedor - 8 15 23 Promedio por muestreo 188.6 89 143.3 167.3 Cuadro 13. Promedios de UFC/cm2 en dilución de superficie. Zona de muestreo 1er muestreo (UFC/cm2) 2do muestreo (UFC/cm2) 3er muestreo (UFC/cm2) Promedio por zona Promedio total Entrada del comedor 161 128 152 147 Centro del patio del comedor 158 106 92 119 108 Cocina del comedor 76 39 63 59 Promedio por muestreo 131 91 102 108 65 Cuadro 14. Especies bacterianas en los puntos de estudio, aire. Especies identificadas P1 (Entrada del comedor) P2 (Centro del patio del comedor) P3 (Cocina del comedor) Enterobacter agglomerans 1 2 3 Enterobacter hafniae 1 0 0 Enterobacter sp. 0 0 0 Klebsiella pneumoniae 1 2 0 Lactobacillus sp. 0 0 0 Proteus morganii 2 1 0 Serratia marcescens 1 0 0 Staphylococcus sp. 0 0 0 Subtotal 6 5 3 Cuadro 15. Especies bacterianas en los puntos de estudio, superficie. Especies identificadas P1 (Entrada del comedor) P2 (Centro del patio del comedor) P3 (Cocina del comedor) Enterobacter agglomerans 0 0 2 Enterobacter hafniae 0 2 0 Enterobacter sp. 2 1 0 Klebsiella pneumoniae 0 2 0 Lactobacillus sp. 0 1 0 Proteus morganii 3 0 0 Serratia marcescens 0 0 0 Staphylococcus sp. 0 1 0 Subtotal 5 7 2 66 Cuadro 16. Género fungí identificadas en los puntos de estudios, aire. Especie identificada P1 (entrada al comedor) P2 (centro del comedor) P3 (cocina del comedor) Geotrichum sp. 2 1 2 Aspergillus sp. 1 1 0 Fusarium sp. 0 2 0 Cuadro 17. Género fungi identificadas en los puntos de estudios, superficie. Especie identificada P1 (entrada al comedor) P2 (centro del comedor) P3 (cocina del comedor) Geotrichum sp. 1 1 1 Aspergillus sp. 1 1 0 Fusarium sp. 0 1 2 Cuadro 18. Número de especies bacterianas identificadas en aire y superficie. Especies identificadas Muestreo en aire Muestreo en alimentos Enterobacter agglomerans 6 2 Enterobacter hafniae 1 2 Enterobacter sp. - 3 Klebsiella pneumoniae 3 2 Lactobacillus sp. - 1 Proteus morganii 3 3 Serratia marcescens 1 - Staphylococcus sp. - 1 67 Cuadro 19. Número de especies de fungi identificadas en aire y superficie. Especies identificadas Muestreo en aire Muestreo en alimentos Geotrichum sp. 3 3 Aspergillus sp. 2 1 Fusarium sp. 1 2 Cuadro 20. Perú se encuentra en la latitud -9.1899672 y longitud -75.015152. Hace parte del continente de América del Sur y está ubicado en el hemisferio sur Inicio Hemisferio sur del planeta Duración de la estación 21 de marzo Otoño Aproximadamente 92.9 días 21 de julio Invierno Aproximadamente 93.7 días 23 de septiembre Primavera Aproximadamente 89.6 días 21 de diciembre Verano Aproximadamente 89.0 días Cuadro 21. Tabla del IMVIC. Tabla del IMVIC según López Indol R.M. V.P. C.S. Proteus morganii - o + + - - o + Enterobacter agglomerans - - + - Enterobacter hafniae - o + + + - Klebsiella pneumoniae - - o + + + Serratia marcescens - - + + 68 Cuadro 22. Tabla de identificación de bacterias por reacciones diagnósticas, clave para separar los distintos géneros de bacterias entéricas (BROCK, 1991). Pruebas bioquímicas ESCHERI CHEAE EDWA RDSIE LLEAE SALMONELLEAE KLEBSIELLEAE PROTEEAE Esch eri chia Shig ella Edw ard sie lla Salm one lla Ari zo na Citrobacter Klebse llapne um onia Enterobacter Serratia Proteus Providencia Freu Ndi Diver sus Cloa cae Aer og en es Hafn iae Agglom erans Marc esce ns Lique fasci ens ribid aea Vulg aris Mira bilis Morg anii Rett geri Alcal ifasci ens Situa rtii INDOL (+) (+o-) (+) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (+o-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (+) (+) MOTILITY (SIM) (+o-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+o-) (+) (+) (+o-) (+) (+) (+o-) (+) (+) (+) METHYL RED (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+o-) (-) (-) (+o-) (+o-) (+o-) (+o-) (+o-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) VOGES PROSKAUES LISINE (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+o-) (+o-) (+) (+o-) (+) (-) (+o-) (-) (-) (-) (-) DESCARBOXY LASE (TSI9 (d) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+o-) (+o-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) GRAS FROM GLCUCOSE (TSI) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+o-) (+o-) (+o-) (d) (+o-) (+) (+o-) (+o-) (+o-) (-) HIDROGENO SULFI (TSI) (-) (-) (+) (+) (+) (+o-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) SIMONS CITRATE (-) (-) (-) (d) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (d) (d) (+) (+) (+o-) (d) (+o-) (-) (+) (+) (+) MALONATE (-) (-) (-) (-) (+) (+o-) (+) (+) (+o-) (+o-) (+o-) (+o-) (-) (-) (+o-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) UREA (-) (-) (-) (-) (-) (d) (d) (+) (+o-) (-) (-) (d) (d) (d) (d) (+) (+) (+) (+) (-) (-) 69 ANEXO B. Lugar de análisis, materiales utilizados, equipos empleados y puntos de muestreo. Figura 7. Laboratorio de Microbiología General donde se analizó las muestras. Figura 8. Balanza analítica y balanza analíticas digital, usadas para los análisis. 70 Figura 9. Incubadora de 37°C y horno usado para análisis. Figura 10. Baño María usado para los análisis. 71 Figura 11. Autoclave y baño maría usados para los análisis. Figura 12. Contador de colonias e incubadora a temperatura ambiente. 72 Figura 13. Refrigerador usado para conservar las muestras. Figura 14. Microscopio electrónico usado para los análisis. 73 Figura 15. Reactivos usados en el análisis de aire y superficie. Figura 16. Preparado de caldo BHI en 100ml de H2O en matraces Erlenmeyer. 74 Figura 17. Materiales de muestreo de aire transportados en caja hermética. Figura 18. Toma de muestra de aire en la entrada del comedor de la UNAS. 75 Figura 19. Toma de muestra de aire en el centro del comedor de la UNAS. Figura 20. Toma de muestra de aire en la cocina del comedor de la UNAS. 76 Figura 21. Toma de muestra de superficies de la entrada del comedor de UNAS. Figura 22. Toma de muestra de superficies del centro del comedor de la UNAS. 77 Figura 23. Toma de muestras de superficie de la cocina del comedor de la UNAS. Figura 24. Aislamiento de bacterias y fungi en placas Petri. 78 Figura 25. Pesado de reactivos. Figura 26. Medios enriquecedores (CLED, Mac Conkey, Manitol Salado, M77). 79 Figura 27. Preparación de medio enriquecedor Mac Conkey. Figura 28. Preparación de medio enriquecedor M77. 80 Figura 29. Preparación de medio enriquecedor Manitol Salt. Figura 30. Preparación de medio enriquecedor CLED. 81 Figura 31. Medios enriquecedores preparados. Figura 32. Sembrado de bacterias de los matraces hacia los medios enriquecedores. 82 Figura 33. Tubos esterilizados para las pruebas bioquímicas. Figura 34. Tubos listos para el sembrado de bacterias (pruebas bioquímicas). 83 Figura 35. Siembra por puntura, estrías y enjuague en pruebas bioquímicas. Figura 36. Colorantes usados en reacciones bioquímicas. 84 Figura 37. Agregando los colorantes a las pruebas bioquímicas. Figura 38. Lectura de pruebas bioquímicas. 85 Figura 39. Lectura de pruebas bioquímicas. Figura 40. Preparado de placas para el cultivo de fungi. 86 Figura 41. Preparación para el cultivo de fungi. Figura 42. Micro cultivo de fungi. 87 Figura 43. Prueba de coloración. Figura 44. Prueba de coloración. 88 Figura 45. Muestras de hongos en láminas porta objetos y cubre objetos. Figura 46. Observando bacterias y fungi por medio de un microscopio. 89 Figura 47. Enterobacter sp observado mediante la visualización microscópica (100X). Figura 48. Lactobacillus sp observado al microscopio con aumento de 100X. 90 Figura 49. Staphylococcus sp observados al microscopio con aumento de 100X. Figura 50. Geotrichum sp observado al microscopio con aumento de 40X. 91 Figura 51. Aspergillus sp observado al microscopio con aumento de 40X. Figura 52. Fusarium sp observado al microscopio con aumento de 40X.