UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA TINGO MARÍA FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Departamento Académico de Ciencia, Tecnología e Ingeniería de Alimentos ~INGOMARI~ ·" "Obtención de.Zumo de Cócona (Solanum topiro) mediante el uso de la Enzima Poligalacturonasa" TE S 1 S Para optar el Título de: INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS JUAN FRANCISCO ROBLES RUIZ TINGO MARÍA - PERÚ 2001 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA Tingo María FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS Los Miembros del Jurado que suscriben, reunidos en acto público el 01 de marzo del 2001, a horas 5:00pm., en la Sala de Grados de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, ubicada en la ciudad de Tingo María, provincia de Leoncio Prado, departamento de Huánuco, para calificar la tesis presentada por el Bachiller en Ciencias Industrias Alimentarias: Juan Francisco ROBLES RUIZ. "Obtención qe Zumo qe Coconct (So/.;¡num topil·o) Meqictnte el Vso de la Enzima Poligalacturonasa" Después de haber escuchado la sustentación, las respuestas a las preguntas formuladas, la declaran aprobada con el calificativo de Bueno, en consecuencia el Bachiller: .Juan Francisco ROBLES RUIZ, queda apto para recibir el título de Ingeniero en Industrias Alimentarias del Consejo Universitario, de conformidad con el Art.22° de la Ley Universitaria 23 733; los artículos 43° y 45° del Estatuto y los artículos 95° y 9W del Reglamento General de la Universidad Nacional Agraria de la Selva. Tingo María, marzo 02 del 2001 . ) 1 / ' :,..;__,. <~0%/ ; Blgo .. JÚ.tio.G}raldo Huayta Presidente Carmen B. ge Castro Gracey Vocal O.ulo• 't consuma~ot ~" nutttslta 6i, que en su sutdimt~. amot t¡ t¡tacia in6inila no1 tptol~'jfd a ~~~ ~att¡o c)g lf.UQSlto caMinat tpct t2.sle mundo '1 nes dá ia 6ot'a~e!l:.a ltGcesatia 'Pattll 9et¡uit ade~anle. a €4 ~Q tpido que aCtQC(Qnle ca~a d{a rm mi da UOcaciÓn ~s u.wiciD e idumine mi enlendimienlt~ tpata comtptendet lf /u:..cQt ctJmptQif.~et qt.t.Q. 0d QS ~a du!i:. '1 ~a ui'Oa. ~ortu11ato compt121l$iÓn. t¡ convian~a. eolt ittrnQft$0 catiñ.o a mis hr;_tmanos: cAliMa y c:Alexa11cLer ittcon)Jicicnad AGRADECIMIENTO Al lng. MSc. Pedro Pablo Peláez Sánchez, patrocinador del trabajo de Investigación. A los docentes de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria de la Selva - Tingo María por las enseñanzas talladas en mi persona que permitieron la culminación de la presente investigación. A todas las personas que colaboraron desinteresadamente en la realización del presente trabajo. IN DICE RESUMEN l. INTRODUCCIÓN 1 11. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 3 A Antecedentes sobre trabajos realizados con cocona 3 B. Aspectos generales de la cocona 5 1. Clasificación taxonómica 5 2. Descripción botánica 5 3. Variedades 6 ,-:\. Características del cultivo 6 5. Producción de cocona a nivel nacional 6 6. Características fisicoquímicas de la cocona 8 7. lndices de madurez 9 C. Enzimas 9 1. Definición 9 2. Clasificación de las enzimas 10 a. Oxidoreductasas 10 b. Transferasas 10 C. Hidrolasas 11 d. U asas 11 e. lsomerasas 11 f. Ligasas 11 3. Factores que afectan la actividad Enzimática 11 a. Efecto de la temperatura 12 b. Efecto del pH y el estado iónico 13 c. Efecto de la humedad 14 d. Efecto de las radiaciones 14 e. Sitio activo y especificidad Enzimática 15 f. Efecto del tiempo 16 g. Efecto de la concentración del sustrato 17 h. Efecto de la concentración de la enzima 17 4. Enzimas pécticas o pectinasas 17 a. Poligalacturonasa 19 b. Pectin esterasa 20 c. Petin Liasa 20 D. Elaboración de Zumos 21 1. Definición 21 2. Requisitos generales 21 3. Operaciones en la elaboración de zumos 22 4. Envases de vidrio 24 5. Tipos de tapas 24 E. Empleo de enzimas en el procesamiento de frutas 25 1. Extracción de jugos 25 2. Generalidades sobre pectinas y sustancias pécticas 26 3. Influencias de pectinas sobre pulpas y turbidez de los zumos de frutas 27 F. Aspectos Reológicos de pulpas y zumos de frutas 30 1. Reología 30 2. Viscosidad 30 3. Tipos de fluidos alimentarios 30 a. Fluido newtoniano 31 b. Fluido pseudopástico 32 111. MATERIALES Y MÉTODOS 33 A. Materia prima e insumes 33 1. Materia prima 33 2. Enzima Poligalacturonasa 33 B. Equipos, materiales y reactivos 33 1. Equipos de laboratorio 33 ' 2. Materiales de laboratorio 34 3. Reactivos y soluciones 35 4. Envases 36 C. Métodos de análisis 36 1. Caracterización de la materia prima 36 a. Determinaciones físicas 36 b. Análisis físico químico 36 c. Análisis físico químico 37 2. Actividad Enzimática de la Poligalacturonasa (PG) y Obtención de zumo 38 a. Actividad Enzimática 38 b. Obtención de zumo 40 3. Viscosidad de la pulpa y el zumo 41 4. Caracterización del zumo y almacenamiento 41 D. Metodología experimental 41 1. Índices de madurez y caracterización de la cocona 42 2. Actividad Enzimática de la Poligalacturonasa (PG) y obtención del zumo 42 a. Actividad enziática de la poligalacturonasa 42 b. Obtención de zumo 42 1 ). Acondicionamiento de la pulpa 42 2). Tratamiento enzimático 45 3). Obtención del zumo. 45 3. Aspectos Reológicos de la Pulpa y el Zumo 49 4. Caracterización del zumo y almacenamiento 49 a. Análisis físico químico del zumo de cocona 49 b. Análisis microbiológico 49 c. Evaluación sensorial 50 E. Diseño Experimental. 50 1. Tratamiento Enzimático. 50 F. Análisis Estadístico 50 IV. RESULTADO Y DISCUSIONES. 53 A lndices de madurez y caracterización de cocona Seleccionada 53 1. lndice de Madurez 53 2. Caracterización de la Cocona 59 a. Determinación físicas 59 b. Análisis químico próxima! 60 c. Análisis físico químico de la cocona 60 B. Actividad Enzimática de la Poligalacturonasa (PG) y obtención del Zumo 62 1. Actividad Enzimática 62 2. Obtención del Zumo 65 a. Acondicionamiento de la pulpa 65 b. Tratamiento enzimático de la pulpa 65 c. Diagrama de flujo final y balance de materia 73 1 ). Diagrama de flujo y balance de materia 73 C. Aspectos Reológicos de la Pulpa de cocona 77 D. Caracterización del zumo y almacenamiento 79 1. Análisis físico químico 79 2. Análisis sensorial 81 3. Análisis microbiológico 82 V. CONCLUSIONES 84 VI. RECOMENDACIONES 85 VIl. BIBLIOGRAFÍA 86 VIII. ANEXOS 92 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Producción mensual de cocona, según Región 7 2. Composición físico-química de la cocona 8 3. Característica de cinco grados de madurez de cocona tipo amaroñado 53 4. Medidas biométricas promedio de la cocona tipo amaroñado 59 5. Análisis químico próxima! de la cocona madura 60 6. Características físicos químicas de la cocona en 100g de parte . comestible 61 7. Resultados experimentales para la determinación de la actividad enzimática de Poligalacturonasa ( PG) 62 8. Rendimiento de zumo extraído por acción Enzimática de la PG sobre la pulpa 67 9. Análisis de Varianza para el rendimiento de zumo extraído, por acción de la Poligalacturonasa 68 10. Promedios ordenados de la prueba de Tukey al 95 por ciento de confianza para el rendimiento de zumo 69 11. Rendimiento de zumo de pulpa de cocona, empleando diferentes concentraciones de enzimas PG a 50° y 90min 72 12. Resultados de la prueba de pectina y almidón 72 13. Balance de materia y rendimiento por operación durante la obtención de zumo de cocona, en base a 100 kg 76 14. Análisis Físico- químico del zumo de cocona durante el almacenamiento 80 15. Resultados de la Evaluación sensorial del zumo de cocona, almacenadas a 60 días 81 16. Análisis Microbiológico del zumo de cocona durante el Almacenamiento 83 17. Análisis de varianza de los rendimientos de zumo de pulpa de cocona por porcentaje de enzima 94 18. Prueba de Rangos múltiples para el rendimiento de la pulpa de cocona por porcentaje de enzima 94 19. Resultados de la Variación de la viscosidad de la pulpa de cocona en ~{tratamiento enzimático 95 20. Resultados para el diagrama reológico de la pulpa de cocona antes del tratamiento con PG 96 21. Resultados para el diagrama reológico de la pulpa de cocona después del tratamiento con PG 97 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura química del ácido poligalacturónico con localización del sitio de acción Enzimática de la poligalacturonasa ( PG), de la pectin esterasa (PE), de la pectin liasa (PL) 2. Medición de la acción de la enzima por el cambio de la viscosidad relativa y test de alcohol 3. Diagrama de bloques para el acondicionamiento de la pulpa de cocona 4. Diagrama de bloques definitivo para la obtención de zumo de cocona mediante hidrólisis Enzimática de la pulpa. 5. Diagrama del diseño experimental para el tratamiento enzimático. 6. Variación del contenido de humedad 7. Variación del contenido de sólidos solubles 8. Variación de la relación Pulpa/ Cáscara. 9. Variación del pH. 10. Variación de la acidez titulable 11. Actividad Enzimática de la Poligalacturonasa (PG) 12. Diagrama de bloques para el acondicionamiento de la pulpa de cocona 13. Diagrama de bloques para la obtención de zumo de cocona, mediante hidrólisis Enzimática de la pulpa 14. Variación de la viscosidad de la pulpa de cocona, por acción de la poligalacturolosa (PG) 15. Diagrama reológico de la pulpa de cocona antes y después del tratamiento enzimático 18 29 43 48 52 56 56 57 57 58 64 66 74 78 78 RESUMEN El presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de la Universidad Nacional Agraria de la Selva Tingo María y la Universidad Privada Antenor Orrego, Trujillo. Se tuvo como objetivos: seleccionar y caracterizar un determinado estado de madurez de la cocona y determinar el efecto enzima poligalacturonasa (PG) sobre la pulpa para obtener el mayor rendimiento de zumo, el cual fue caracterizado física química, microbiológica y sensorialmente durante el almacenamiento. Se evalúo cinco estados de madurez de cocona (Solanum topiro) que comprendió de verde hasta maduro; seleccionándose el fruto maduro, el cual fue utilizado ~ra el tratamiento enzimático y la obtención de zumo. Este estado presentó un índice de madurez de 6,0 con un contenido de humedad de 92,78 por ciento, carbohidratos 4,2 por ciento y proteínas 1,74 por ciento. La actividad de la PG fue de 292 U/mi a 30°C y pH 5, O, utilizando el método iodimétrico. El mejor resultado se obtuvo al hidrolizar la pulpa con 0,03 por ciento de PG a sooC/90 min, con el cual se logró un rendimiento de 83,39 por ciento después del prensado y 78,86 por ciento después del centrifugado, en base a la pulpa acondicionada. El zumo fue almacenado en frascos de vidrio transparente de 180 mi por 60 días a temperatura ambiente y refrigeración; seleccionándose como más estable los zumos almacenados a refrigeración (4°C), caracterizándose sensorialmente como bueno, en los atributos sabor y aroma y presentando un color amarillo claro. ABSTRACT The present research is accomplished in laboratories of the university: Universidad Nacional Agraria de la Selva, Tingo María and the university: Universidad Privada Antenor Orrego, Trujillo-Perú. lt having as objetive to select and to characterize a given maturity state of the cocona fruit (Solanum topiro) and to determine the enzyme effect polygalacturonase (PG) on the pulp in arder to obtain the greater juice yield, the one which was characterized chemical, physical, microbiology and sensorial during storage. lt is evaluated five ripe states of cocona fruit from green until ripe; it Was select the ripe fruit whi.ch was used for the enzyme treatment and the obtention off juice. This state presented a maturity index of 6,0 with a moisture content of 92,78 percent, carbohydrates 4,2 percent and proteins 1,7 4 percent. The activity of the PG was of 292 U/mi at 30°C and pH 5,0 using iodimetric method. The best result was obtained to hydrate the pulp with 0,03 percent of PG at sooc during 90 minutes; with this procedures were obtain a yield of 83,39 percent after pressed and 78,86 percent after to the centrifuged, in base to the conditioned pulp. The juice was stored in transparent glass flasks of 180 mi during 60 days at room temperature and refrigeration; they were selected as more stables the juices stored at refrigeration (4°C) characterized sensorial as good in the flavor attributes and the aroma and presenting a clear yellow color. l. INTRODUCCIÓN La amazonía peruana presenta una considerable producción de frutos de distintas especies y variedades, las cuales constituyen un desafío para el hombre ya que la gran demanda de alimentación hace pensar en buscar la tecnología necesaria para poder aprovecharlas, y permitir un mayor aprovechamiento del fruto; lo cual puede incidir en los índices de producción agrícola beneficiando al agricultor de la zona. La cocona (Solanum topiro), un frutal nativo dentro de la gran variedad de frutales con que cuenta el país y que posee cualidades organolépticas muy aceptables, al igual que la mayoría de productos alimenticios es perecedero por deterioro fí~ico, químico y biológico. Frente a este problema se plantea la necesidad de desarrollar métodos adecuados de procesamiento. El proceso para la obtención de zumos de frutas tropicales es una alternativa de fácil aplicación, sin embargo, como todos los procesos tecnológicos esta sujeto a ciertas limitaciones, que en definitiva son superables. Algunos de los problemas que se presentan en el procesamiento de zumo de frutas son la estabilidad del color, la clarificación debido a la presencia de agentes enturbiantes, la viscosidad excesiva y los bajos rendimientos, ocasionados por la alta concentración de polisacáridos estructurales de la pared celular, los que inducen a realizar una hidrólisis enzimática de la pulpa previo a la extracción del zumo. En tal sentido se planteó el siguiente trabajo de investigación cuyos objetivos fueron seleccionar y ~racterizar el grado de madurez óptimo para la obtención de 2 zumo de cocona, determinar la actividad enzimática de la poligalacturonasa y las mejores condiciones para un mayor rendimiento de zumo así como evaluar las características físico-químicas, microbiológicas y sensoriales del zumo durante 60 días de almacenamiento. El trabajo fue ejecutado de Junio de 1997 a Mayo de 1998. ; , 11. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA A. ANTECEDENTES SOBRE TRABAJOS REALIZADOS CON COCONA Determinación de los parámetros tecnológicos para el procesamiento de conservas de cocona (Solanum topiro) en almíbar; se realizó con la finalidad de preservar la cocona en forma de conserva en almíbar mediante la determinación del flujo de procesamiento y los parámetros óptimos. Se estudiaron los principales parámetros de cada operación y las características de control de calidad para obtener un flujo adecuado en la elaboración de conserva de cocona. El flujo definitivo para la elaboración de conserva de cocona es el siguiente: Selección, Lavado, Pelado ( NaOH 2%; ebulli,c.i.ón por 10 min), Cortado, Despepitado, Blanqueado (Temperatura de ebullición por 3,5 min), Llenado (Almíbar a 80° C), Envasado, cierre, tratamiento térmico (25 m in a 1 ooo C, temperatura de retorta), Enfriado (35 a 40° C), Almacenaje (Temperatura ambiente y luz moderada) (Manayay, 1986). Evaluación de las propiedades reológicas de la pulpa y néctar de dos tipos de cocona (Solanum topiro); los objetivos fueron evaluar el comportamiento reológico la pulpa y néctar de cocona y estudiar la aplicación de las propiedades reológicas en cálculos para ayudar en el diseño de máquinas y equipos en posteriores trabajos de investigación. Este trabajo se divide en tres etapas: 1. El estudio de la materia prima con el objeto de conocer las características físicas, la composición química próxima! y el análisis 4 físico-químico para relacionarlo con las propiedades reológicas. 2. La obtención de la pulpa y la evaluación reológica con el objeto de cumplir con los parámetros recomendados por INDECOPI (ITINTEC) y determinar sus propiedades reológicas. 3. La obtención de néctar de cocona y evaluación reológica, con el objeto de determinar la variabilidad de sus propiedades reológicas con relación a los de pulpa (Carmona, 1989). Estudio para la prevención de la cocona (So/anuro topiro) al estado fresco por método de Parafinado; el estudio se realizó en dos etapas, en la primera se estudiaron los parámetros óptimos en las operaciones de flujo a seguirse en el tratamiento con parafina. La segunda comprende la prueba definit!ya del tratamiento· con parafina con el siguiente flujo de operaciones: Recolección, Selección, Lavado, Clarificación, Desinfección, Secado, Parafinado, Enfriado, Escurrido, Empacado, Pesado y Almacenado . Se realizaron controles físico-químico semanalmente en las muestras . parafinadas. Habiéndose logrado la conservación al estado fresco de la cocona del tipo aperado mediante el parafinado hasta seis semanas (Guere, 1990). 5 B. ASPECTOS GENERALES DE LA COCONA. 1. Clasificación Taxonómica Reino Vegetal División Tracheophyta. Subdivisión Pteropsidia . Clase Angioespermae Subclase Dicotiledóneas Orden Tubiflorales Familia Solanáceas Género Solanum Especie Solanum topiro H.R.K. Nombre Común Cocona. ·' ~ 1" En Ecuador, Colombia y Perú es conocido como cocona y en Venezuela como topiro ( Hill, 1964; Calzada, 1980). 2. Descripción botánica La Cocona, planta nativa del alto Amazonas del Perú, de rápido crecimiento, al principio herbácea y después se torna leñosa. Alcanza una altura de 0.5 a 2 m, el tallo es cilíndrico con abundante pubescencia en su primera edad, ramifica desde el suelo. Las hojas son ovaladas, grandes de 30 a 50 cm de largo y de 20 cm a 30 cm de ancho con lóbulo acuminado; las flores de 4 a 5 cm, de diámetro se presentan en racimos axilares cortos, los frutos varían desde casi esféricos u ovoides hasta ovalados de 5 a 12 cm de ancho y de 3 a 6 6 cm de largo, color desde el amarillo hasta el rojo; la cáscara del fruto es suave como la del tomate y la pulpa es oscura de color amarillo fijo, fraganciosa y de sabor suigéneris (ácido y dulce). La semilla esta envuelta en un mucílago transparente. (Calzada, 1980). 3. Variedades No se habla de la existencia de variedades de cocona, tan solo se hace mención de tipos de cocona, diferenciándose nueve tipos clásicos de fruta: amaroñado, aperado, oblongo, atomatado, cilíndrico,alagado, oblado, redondo,elipsoideo y aciruelado ( Calzada, 1980). 4. Características del cultivo La cocona crece en climas cuya temperatura oscila entre 18° C y 2rc, ~~n humedad relativa de 70% y 90%, con una precipitación pluvial de 1500 a 4000 mm3 , al año: estas Condiciones solo lo hacen adaptable a clima de selva. Se adapta bien a suelos con un pH de 4 a 7, de textura arcillosa a franca y ricos en materia orgánica. Por ser una planta muy agotante del suelo no puede repetirse el cultivo en el mismo terreno(Calzada, 1980). 5. Producción de cocona a nivel nacional En la tabla 1 , se muestra la producción de cocona a nivel nacional según la región; apreciándose que las mayores producciones en el año 1999 correspondieron a las regiones Ucayali y Loreto con 5317 y 352 T.M. Tabla 1. Producción mensUal de Cocona, según Región, 1999 (TM) REGION Total Ene. Feb. Mar. Abr. M ay. Jun. Jul. Ago. Se t. Oct. Nov. Dic. ·NACIONAL 6200 493 572 644 452 ·. 374 299 354 561 700 540 677 534 Tumbes Piura Lambayeque Cajamarca Cajamarca Chota Jaén Amazonas La Libertad Ancash Lima lea Huancavelica Aya cucho Apurimac Abancay Andahuaylas Arequipa Puno Moquegua Tacna Cuzco Madre de Dios Ucayali 5317 456 533 601 411 317 263 314 433 555 415 529 490 Huánuco 189 22 20 18 17 18 10 14 14 16 11 16 17 Paseo - - - - - - - - - - - - - Junín 73 1 6 3 13 8 12 3 3 7 5 4 8 San Martín 269 14 13 22 11 31 14 15 37 42 23 28 19 Lo reto 352 - - 12 74 80 86 100 - - Fuente: Direcciones Regionales de Agricultura. Oficina de Información Agraria. Elaboración: MINAG-OIA. 8 6. Características físico químicas de la cocona La cocona es un frutal climatérico que presenta dos períodos en su desarrollo. El primer período es de reserva de almidón en el cual la fruta presenta un contenido bajo en azúcar soluble, fija sus reservas de almidón a expensas de los azúcares reductores. El siguiente período es de maduración, y aquí los azúcares reductores solubles son formados a partir del almidón (Wills, 1990, citado por Peláez, 1998 ). A continuación presentamos en la tabla 2 las características físico- químicas de la cocona. Tabla 2. Composición físico-química de la cocona ANÁLISIS PINTONA MADURA SOBRE MADURA Humedad 92,50 93,30 87,58 Sólido Total 7,50 6,70 12,42 Sólido Sol. 4,10 4,40 4,60 Acidez Titul. 8,69 7,06 5,20 lndice de Mad. 5,06 6,23 8,35 pH 3,83 3,89 4,25 Vitamina C 2,80 3,50 4,20 Azúcares red. 1,09 1,10 1,15 Fuente: Manayay (1986) 9 7. lndices de madurez El índice de madurez puede ser determinado de muchos formas, incluyendo la estimación de la duración de desarrollo; mediciones de tamaño, peso o densidad, atributos físicos, tales como color, firmeza y humedad o contenido de sólidos; atributos químicos, como almidón, azúcares o contenido de ácidos; evaluación morfológica (Shewfelt, 1993). La madurez fisiológica se refiere a aquel estadio en el desarrollo de la fruta en el que se ha logrado el crecimiento y la maduración máximas. C. ENZIMAS 1. Definición Las enzimas son biocatalizadores complejos de naturaleza proteíca de gran especificidad y eficiencia, producidos por células de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones biológicas a través de vías bien definidas y cuya actividad está sujeto a regulación (Schmidt-Hebbel, 1982). A diferencia de un catalizador inorgánico, las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente sólo catalizan un tipo de reacción o sólo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcada que en general, actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa. Las enzimas por lo tanto, se consideran como catalizadores altamente específicos que: 10 a. Modifican la velocidad de los cambios promovidos por ellas. b. Determinan que sustancias particulares, de preferencia a otras distintas, son los que van a sufrir los cambios. c. Impulsan dentro de los distintos cambios posibles que pueda seguir una sustancia, cuál de ellos en especial será el utilizado. Los sistemas enzimáticos, en general, están formados por la enzima propiamente dicha (apoenzima), el sustrato o los sustratos, un grupo prostético (o coenzima) y sustancias activadoras. La estructura formada por la apoenzima y la coenzima se denomina holoenzima (Braverman, 1980; Adrián, 1990). 2. Clasificación de las enzimas ~9ra uniformizar la nomenclatura la comisión IUPAC-IUB en Biochemical Nomenclature-Revisec Enzyme Nomenclature 1984, nombra y clasifica a las enzimas en seis epígrafes, de acuerdo al tipo de reacción química y a su mecanismo de acción .Se clasifican en: a. Oxidorreductasas Catalizan reacciones de óxido reducción por transferencia de hidrógeno o por la incorporación de oxígeno al sustrato. Ejemplo: reductasas, oxidasas, oxigenasas, catalasas, hidroxilasas y otros. b. Transferasas Catalizan varios tipos de transferencia de grupos de una molécula a otra (Transferencia de grupos amino, carboxilo, carbonilo, metilo, glicosilo, acilo o fosforito). Ejemplo: aminotransferasas (transaminasas). 11 c. Hidrolasas Catalizan reacciones que implican la ruptura hidrolítica de enlaces químicos tales como C=O, C-N, C-C. Sus nombres comunes se forman añadiendo el sufijo asa al nombre del sustrato. Ejemplo: lipasas, peptidasas, amilasas, pectinoesterasa, maltasa y otras. d. Liasas También catalizan la ruptura de enlaces C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo enlaces peptídicos, pero no por hidrólisis. Ejemplos: descarboxilasas, citrato-liasa, deshidrolasas y aldolasas. e. lsomerasas Catalizan transposiciones intermoleculares, tales como: la '.· isomerización y la mutarrotación. Ejemplo, epimerasas, racemasas y mutasas. f. Ligasas Catalizan la formación de enlace entre C y O, S, N y otros átomos. Generalmente, la energía requerida para la formación del enlace deriva de la hidrólisis del ATP. Las sintetasas y carboxilasas están en este grupo (Schmidt Hebbel, 1982; Robinson, 1991 ). 3. Factores que afectan la actividad enzimática La importancia de las enzimas para la ciencia de los alimentos, esta con frecuencia determinada por las condiciones que prevalecen en el interior y el exterior del producto. Para regular la actividad enzimática es necesario conocer tales condiciones. Por lo que a continuación presentamos los principales factores que afectan a la actividad de las 12 enzimas. a. Efecto de la Temperatura La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas con pocas excepciones está entre 30 y 40°C, donde la actividad es máxima, en casi todas las enzimas la velocidad de reacción se duplica a triplica cuando la temperatura se incrementa en 10°C. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima, por desnaturalización térmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los sooc la mayoría de las enzimas, pero no todas, se desnaturan, y unas pocas muestran desnaturalización cuando se . , .· enfrían aproximadamente a soc (Schmidt-Hebbel, 1982). Al principio de la desnaturalización los enlaces hidrófobos iónicos y electrostáticos se debilitan y ante un aumento en la energía cinética permite en conjunto la rotación de las uniones, lo que cambia la posición normal de los grupos radicales importantes (Segel, 1982). A medida que aumenta la temperatura,. Ocurren dos reacciones simultáneas: 1) La velocidad de reacción aumenta como sucede en la mayoría de las reacciones químicas. 2) La estabilidad de las enzimas disminuye por inactivación térmica (Quintero, 1987). Como se sabe, las enzimas son moléculas proteícas complejas, su actividad catalítica se debe a una estructura terciaria altamente 13 ordenada y exacta que yuxtaponen a los grupos R- de aminoácidos específicos. La estructura terciaria de una enzima se conserva en primer lugar por un gran número de enlaces débiles no covalentes, es decir una molécula de enzima es una estructura frágil y muy delicada. Si la molécula absorbe demasiada energía, la estructura terciaria se rompe y la enzima se desnaturaliza, perdiendo actividad catalítica (Segel, 1982). b. Efecto del pH y el estado iónico La actividad enzimática guarda también relación con el estado iónico de la molécula y especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptídicas contienen grupos que pueden ionizarse (principalmente grupo~ carbolíxicos y aminos de los aminoácidos· constituyentes} en un grado que depende del pH existente. El pH óptimo de los enzimas varía ampliamente, sin embargo, la gran mayoría tiene un óptimo entre 4 y 8. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH se desnaturaliza (Schmidt-Hebbel, 1982}. Los sitos activos de los enzimas se componen a menudo de grupos ionizables que deben encontrarse en forma iónica adecuada, con el fin de mantener la conformación del sitio activo, unir los sustratos o catalizar la reacción, además uno o más de los sustratos pueden contener grupos ionizables y solamente una forma iónica del sustrato puede unir al enzima o experimentar: la catálisis (Segel, 14 1982). El pH es el factor que más influye en la titulación de los grupos ionizables que mantienen la carga en la superficie, actúan en el sitio activo o estabilizan la enzima; cualquier modificación del o debida al pH altera estas condiciones; se puede decir, pues que existe un pH óptimo para la enzima (Quintero, 1987). c. Efecto de la Humedad En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biológico, el agua es uno de los componentes más importantes. Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas moléculas que interactúan. Además, la reactividad de .. muchas sustancias depende de la disociación iónica y de la configuración molecular y, por lo tanto de la hidratación. El agua es a menudo uno de los reactantes o uno de los productos de la reacción. La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimática aumenta al aumentar el contenido de agua libre y ello ocurre no sólo en las reacciones hidrolíticas, en las que el agua es uno de los reactantes obvios, sino también en las reacciones no-hidrolíticas (Schmidt-Hebbel, 1982). d. Efecto de las Radiaciones Las radiaciones del tipo-electromagnético o corpuscular pueden tener una acción desnaturalizante sobre los enzimas esto es provocado por la ruptura de enlaces, desaminación y 15 descarboxilación de los residuos de ácidos aminados o la ruptura de enlaces peptídicos, o sea directamente modificando las características físicas del medio (Scriban, 1988). La inactivación por luz ultravioleta se debe a la fotólisis de grupos disulfuro y aromático de los aminoácidos que constituyen las proteínas; por lo que la luz ultravioleta no es de aplicación práctica en la tecnología alimentaria. En cambio, la irradiación de los alimentos con radiaciones ionizantes (radiaciones beta, gamma, etc.) es de considerable importancia en el procesamiento de alimentos (Schmidt-Hebbel, 1982). e. Sitio activo y Especificidad Enzimática · .' Cuando una enzima reacciona con su sustrato, sólo ciertas regiones de la molécula de proteína, conocidos como "sitios activos", participan en el proceso, los sitios activos consisten en grupos especiales de residuos de aminoácidos, cercanos entre si debido a la secuencia y al plegamiento particular de la proteína enzimática. La existencia de un complejo enzima-sustrato se dedujo a partir de: El alto grado de especificidad que presentan las enzimas. La forma de la curva de velocidad frente a concentración de sustrato. El hecho de que frecuentemente los sustratos protegen a las enzimas de la inactivación. El alto grado de especificidad explica que el enzima posee esta región llamada sitio activo, que es complementaria en tamaño, forma 16 y naturaleza química de la molécula del sustrato. El sitio activo de una enzima ocupa sólo una porción muy pequeña de la molécula, de hecho puede haber solamente una docena, más o menos, de residuos de aminoácidos rodeando la cavidad de absorción y de estos, dos o tres pueden realmente participar en la unión con el sustrato y/o en las catálisis (Braverman, 1980; Segel, 1982). Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por su sustrato: El sustrato debe poseer el enlace químico específico o unión, que debe ser atacado por la enzima. El sustrato debe poseer habitualmente algún otro grupo funcional, un grupo de unión, que se une a la enzima y ubica en posición a la molécula de sustrato de modo que el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relación al sitio activo de la enzima (Schmidt-Hebbel, 1982). f. Efecto del tiempo Cuando se efectúa una reacción enzimática, se observa un aumento en la concentración del producto y una disminución en la concentración del sustrato hasta que la reacción termina o alcanza su punto de equilibrio. El cambio observado en la concentración inicial respecto al tiempo se denomina velocidad inicial de reacción y en general se expresa en unidades internacionales o en moles de producto por minuto (Quintero, 1987). 17 g. Efecto de la concentración del Sustrato En una reacción enzimática, se pueden distinguir tres etapas, en la primera una enzima (E) se mezcla con un sustrato (S) y la reacción entre ellos produce el complejo enzima-sustrato (ES); esta interacción es tan rápida que resulta difícil estudiarla sin equipos. El producto (P) aumenta simultáneamente con el aumento de ES hasta alcanzar un régimen estacionario, momento en que la velocidad de formación del producto es constante. Esta velocidad constante de formación se denomina velocidad inicial de reacción (Quintero, 1987). h. Efecto de la concentración de la Enzima .. - , No solo es necesario conocer si una enzima dada está presente, sino también en que cantidad. Bajo condiciones apropiadas, la velocidad de una reacción catalizada por una enzima será directamente proporcional a la concentración de la enzima (Mayes, 1988). 4. Enzimas pecticas o pectinasas Las pectínasas son un complejo de enzimas que hídrolizan las sustancias pécticas, que se clasifican de acuerdo con el sustrato (pectina o ácido péctico), del tipo de reacción (hidrólisis o transeliminación) y del mecanismo (endo o exo). Figura 1. Las enzimas comerciales provienen generalmente de Aspergil/us niger, dado que es el microorganismo que mayor número de éstas produce (García et al., 1993). COOH OH PG e D Ácido péctico COOH CO.OCH3 OH PL PE e D COOH COOCH3 i___ J ' OH OH Ácido pectínico Ácido Poligalacturónico (enlaces a , 1 - 4) Fuente: Chitarra (1990) ; Fennema (1993) OH Figura 1: Estructura química del ácido poligalacturónico con localización del sitio de acción enzimática de la Poligalacturonasa (PG), de la pectinesterasa (PE) y de la pectinliasa (PL) 19 El término pectinasas o enzimas pectolíticas concierne sólo a las enzimas que degradan la parte galacturónica de estas sustancias. En cambio, las enzimas que degradan las cadenas laterales (arabinasas, galactanasas, etc.), no están consideradas como enzimas pectolíticas. En consecuencia, las enzimas que degradan los enlaces a (1-4) entre los residuos de ácido galacturónico y las enzimas desesterificantes de estos ácidos constituyen el grupo de pectinasas (Schmidt-Hebbel, 1982; Badui, 1984). a. Poligalacturonasas (PG) (EC. 3.2.1.15). Las Poligalacturonasas se encuentran naturalmente en plantas y microorganismos. Su acción sobre el ácido péctico provoca la , aparición en cantidad creciente de grupos reductores y por otra parte una disminución progresiva de la viscosidad. La determinación del aumento del poder reductor y la medida de la disminución de la viscosidad son dos métodos utilizados para determinar la actividad Poligalacturonasa (Braverman, 1980; Badui, 1984; Fennema, 1993). Esta enzima rompe los enlaces a 1-4 de las cadenas no esterificadas de las pectinas y las transforma en oligogalacturonidos o ácido galacturónico,(monómero), reduciendo considerablemente su viscosidad (Adrián, 1990). Además hidroliza los enlaces glucosídicos próximos a los grupos carboxílicos libres, en consecuencia pectinas de alto grado de metilación (HM) son difícilmente atacados, mientras que pectinas de bajo grado de metilación (LM) son fácilmente atacados, siendo el 20 pectato el mejor sustrato. Esta enzima además de catalizar la hidrólisis de la unidad glucosídica entre las unidades de ácido galacturónico, también puede atacar al de las pectinas. Estas enzimas "licuantes" atacan las moléculas al azar, rompiéndolas en cadenas más cortas, y si la hidrólisis se produce en el interior de la molécula, estas reciben el nombre de "endo-PG", o si la molécula se va acortando desde un extremo, es por las "expo-PG" o enzimas "PG sacarificantes". Las Endo-PG tienen la capacidad de reducir rápidamente la viscosidad de una solución de pectina. Todas ellas son activas en presencia de CINa, y algunas también además por los iones Ca2+. Su pH óptimo se encuentra entre 4,0 y 5,5 (Pilnik, 1978; Braverman, 1980; Belitz, 1988). b. Pectin esterasa (PE) (EC.3.1.1.11) La Pectin esterasa desmetoxila las cadenas pécticas a ácidos pécticos; esta enzima es una esterasa específica que sólo hidroliza los grupos carboxilo esterificados en la pectina. Las temperaturas elevadas (70° a 90°C) pueden inactivar a esta enzima así como las concentraciones elevadas de azúcar. Esta enzima esta ampliamente distribuida en las plantas y lo producen los hongos (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum), levaduras, bacterias y algunos vegetales (Adrián, 1990; Belitz, 1988; Robinson, 1991). c. Pectin Liasa (PL) (EC.4.2.2.10) El modo de acción de esta enzima implica la transeliminación de un protón del átomo del carbono 5 de un residuo urónico y la ruptura 21 simultánea del enlace glicosidico adyacente. La enzima se encuentra en plantas superiores y en los microorganismos y es capaz de emplear como sustrato a pectinas menos metoxiladas (Robinson, 1991). D. ELABORACIÓN DE ZUMOS 1. Definición El zumo de fruta es el líquido obtenido de la prensión de las frutas, no diluido, no concentrando, no fermentado y sometido a un tratamiento adecuado para asegurar su conservación en envases herméticos (lndecopi, 1976). 2. ~equisitos generales El jugo deberá ser extraído en condiciones sanitarias, de frutas maduras, frescas, sanas, limpias, cuidadosamente lavadas y libres de restos de insecticidas, fungicidas y otras sustancias eventualmente nocivos. Podrá llevar en suspención pulpa de fruto finamente dividida. Deberá estar excento de trozos de corteza, semilla y fragmentos gruesos y duros. No se permitirá la adición de sustancias que modifiquen la naturaleza del jugo, salvo lo estrictamente necesario de azúcar refinado o ácido cítrico para ajustar la relación de sólidos solubles y acidez titulable, cuando así lo autorice la norma correspondiente; ácido ascórbico como antioxidante y vitaminas como enriqüecimiento. Se fijará en cada caso la acidez titulable máxima, no se permitirá la adición de colorantes artificiales (lndecopi, 1976). 22 3. Operaciones en la elaboración de zumos En el procesamíento de zumo se debe seguir las siguientes operaciones: Tratamientos preliminares Consisten en la preparación de la fruta, la cual es sometida a selección, lavado, calibrado, inspección, acondicionamiento; según modalidades y aparatos adaptados a cada caso. Extracción de zumo Los zumos de frutas se extraen por diversos métodos, según la estructura de la fruta, su composición química y los caracteres que se deseen conseguir para la bebida, como por ejemplo: transparencia, }!scosidad, astringencia más o menos grande. Es común utilizar en esta operación la trituración y el tamizado. El triturado de la fruta puede ser llevado . a cabo en forma mecánica en molinos especiales para frutas. El rendimiento en zumos de las frutas puede ser incrementado por ·tratamiento con enzimas pectinolíticas (maceración digestiva, especialmente indicados en bayas y drupas) (Belitz, 1988; Cheftel, 1980). Clarificación Esta operación se emplea para la preparación de zumos claros, facilitando la separación de partículas responsables de la turbidez, también asegura la estabilidad tratando de evitar la aparición de nuevas turbideces. 23 Filtración Se emplea con la finalidad de conseguir total brillantes; exclusivamente para la terminación de los zumos para ello se debe adoptar una asepcia rigurosa y un filtrado a través de materiales porosos (asbestos, celulosa, tierra de diatomeas) o por centrifugación. Desaireación Se realiza haciendo pasar el zumo en un recipiente bajo vacío para eliminar el gas disuelto, naturalmente conviene recordar que no tiene interés desairar zumos de frutas si al mismo tiempo no se toman medidas para evitar la reincorporación del aire. Asimismo, no deben desairarse zumos que pueden perder su aroma natural. Pasteurización •• -l ~ ' •. El método más utilizado para la conservación de zumos es el tratamiento térmico, cuyo pH es inferior a cuatro, este efecto es fácil de alcanzar, sólo se necesita eliminar a las levaduras, mohos y algunas bacterias tácticas y acéticas. El tratamiento térmico manteniendo a una temperatura escogida durante un tiempo determinado conduce a la muerte de los microorganismos e inactivación de las enzimas que puedan alterar el producto y hacerlo inapropiado para el consumo humano. En el caso de zumos de frutas, cuyo pH es normalmente inferior de 4,0, este efecto es fácil de alcanzar (Belitz, 1988). Llenado en caliente y autopasteurización Consiste en someter el zumo de fruta a una pasteurización relámpago y enfriarlo inmediatamente hasta 82°C a 85°C, para introducirlo a los 24 envases (previamente calentados sí son de vidrio) a esta temperatura (Cheftel, 1980; Belítz, 1988). 4. Envases de vidrio El vidrio es un silicato complejo compuesto esencialmente de sílice (Si02), óxido de sodio (Na20) y óxido de calcio (CaO); el vidrio a pesar de su consistencia, no es una sustancia sólida, sino un líquido de viscosidad muy elevada, su fluidez varía con la temperatura sin discontinuidad y no se observa ni punto de fusión, ni punto de solidificación (estado vitrio). Desde el punto de vista químico, el vidrio es inerte a la temperatura ordinaria frente a los productos alimenticios acuosos o lipídicos y a los diversos ácidos orgánicos que pueden existir en forma natural en los alimentos. Otra propi~dad del vitrio llamado "blanco", es la transparencia, ventaja muy considerable para la presentación de algunos productos (Cheftel, 1980). 5. Tipos de tapas Existen innumerables tipos de cápsulas y tapas, cada uno adaptado a determinado sistema de apertura o boca. Fundamentalmente las primeras materias que se utilizaron fue la hojalata, chapa negra, aluminio y diversos "materias plásticas", presentados bajo la forma de tapones flexibles o bien rígidos. A esta cápsula se le denomina el "tapón corona" y es el más generalizado para las botellas; se coloca por presión y apretado del metal bajo el bordillo (abultamiento) de la boca (Cheftel, 1980). 25 E. EMPLEO DE ENZIMAS EN EL PROCESAMIENTO DE FRUTAS La tecnología moderna se orienta al uso de una gama, cada vez más; amplias de materias primas y al aprovechamiento integral de estas; esto origina una gran variedad de productos terminados, lo que ha sido posible gracias a las innovaciones de procesos y equipos. En muchos de los procesos modernos, se utilizan enzimas como celulasas, pectinasas, amilasas y proteasas. Estas enzimas catalizan la degradación de los constituyentes de las paredes celulares tales como la celulosa, hemicelulosa, pectina, almidón y proteína (Braverman, 1980; Fennema, 1993; Fellows, 1994). En la elaboración de bebidas y jugos vegetales, las enzimas juegan dos roles; una función específica, ejercida por su presencia en forma natural en las materias primas y de otra parte transformaciones específicas cuando se adicionan enzimas (preparaciones industriales), que mejoran las características organolépticas y se realizan nuevos procesos de producción. Este último aspecto demandará importante trabajo, puesto que la acción de enzimas pécticas sobre sistemas complejos tales como las bebidas no ha sido totalmente transparente (Campos, 1994; Fellows, 1994). 1. Extracción de jugos El tratamiento enzimático de la pulpa, antes del prensado es necesario para la extracción del jugo de frutas pequeñas como: fresa, cereza, uvas, etc. En estas frutas ricas en pectinas, la acción mecánica sobre la fruta da un jugo muy viscoso. La pectina podría dar origen a una masa semigelificada, que dificulta la extracción del jugo. Las enzimas 26 pectinolíticas degradan esta estructura gelificada y facilitan la extracción. Además de mejorar la extracción, la presencia de pectinasas; así como de otras hidrolasas: celulasas y hemicelulasas; favorecen la extracción de pigmentos, sabores y aromas; mejorando así las características organolépticas (Oziezak, 1991 ;Campos, 1994). 2. Generalidades sobre pectina y sustancias pecticas. Las pectinas son un grupo especial de sustancias responsables de la formación de geles, se encuentran en cantidades tan abundantes que a menudo forman canales anchos, apartando entre sí a las células, al ser un coloide hidrofílico, la pectina tiene la capacidad de absorver grandes cantidades de agua ( Braverman, 1980; Robinson, 1991 ). Las sustancias pécticas -~e encuentran en las paredes celulares del tejido de la planta y también en la lámina media, también actúan como cemento intercelular entre las paredes de la célula y son polímeros del ácido 0- galacturónico unido por el enlace a-1, 4-glucosídico, un número limitado de residuos del azúcar ramnosa interrumpen la cadena del ácido galacturónico, la cantidad de material péctico varía con cada fruta y con los tejidos de la fruta en particular, la cáscara, el área central, son las fuentes más ricas en pectinas que el tejido parenquimatoso, la savia celular constituye el jugo de la fruta extraído en frío; rara vez contiene pectina. La proporción de proto pectina, pectina y ácido péctico en una fruta varía con su madurez. La proto pectina produce una pectina 27 dispersable en el agua cuando el tejido de la fruta se extrae con agua caliente. A medida que la fruta se acerca a la madurez, el contenido de proto pectina disminuye y predomina la pectina dispersable en agua. En los ácidos pécticos, los grupos carboxilo de los residuos del ácido galacturónico en el polímero, no están esterificados, forman sales, igual que otros ácidos, se depositan en el tejido de la planta como pectato de calcio o magnesio. Los ácidos pectínicos (llamado pectina), tiene grupos metílicos esterificados en alguno de los grupos carboxilo a lo largo del polímero del ácido galacturónico (Badui, 1984). 3. Influencia de pectinas sobre pulpas y turbidez de los zumos de frutas Las sustancias pécticas presentes en las frutas se deben tener en cuenta no sólo en la obt~nción de geles sino también en la fabricación de zumos de frutas, vinos y vinagres. La pectina, en solución en zumos de frutas, contribuyen a mantener en suspensión las finas partículas de "pulpa" que le dan turbidez, la suspención es consecuencia de la naturaleza coloidal del fluido, las sustancias que producen esta solución coloidal varían con los distintos zumos, pero por lo general, son pectinas y polisacáridos asociados, derivados del almidón, diversas proteínas y ocasionalmente, taninos y ligninas, dichos zumos se sedimentan muy lentamente y no pueden filtrarse con facilidad por cuanto obstruyen los filtros. En algunos zumos es de interés protegerlos, pues confiere al producto una cierta viscosidad y actúa como coloide protector, contra la acción 28 de enzimas proteolíticas y se consigue con una pasteurización apropiada. Por el contrario, cuando se desea la obtención de un zumo claro es indispensable eliminar la pectina porque su presencia en solución haría muy difícil la decantación y filtrado, en este caso se utilizan enzimas pectolíticas comerciales que poseen una fuerte actividad poligalacturonásica, además, ésta es indispensable, porque la Poligalacturonasa actúa sobre el ácido péctico. La pectina dificulta la liberación del zumo de la pulpa, haciendo que escurra lentamente, debido a su viscosidad elevada (Cheftel, 1980; Belitz, 1988). Además el almidón es otro de los causantes de la elevada viscosidad del zumo. La pectina actúa como estabilizante de los turbios en el zumo, es decir, los zumos no pueden ser clarificados por centrifugación o filtración; zumos conteniendo pectina no pueden concentrarse mucho, pues gelifican y se queman durante el proceso. Los zumos y pulpas turbios, requieren pectina para conseguir su estabilidad a la turbidez. Para la fabricación de confituras se añaden pectinas con alto poder de gelificación. Las enzimas desdobladoras de pectinas las hidrolizan a fracciones de bajo peso molecular, con lo que se elimina la viscosidad y destruye el poder gelificante (Díaz, 1992). La acción de las enzimas pectolíticas se puede controlar por la medición de la viscosidad relativa del zumo o pulpa, también comprobando la pectina restante, mediante la prueba de alcohol (Viquez, 1981) indicado en la figura 2. 1 1 1 1 .,' ~ ..,"' ,;/ V ....._ ..... ...... 1 .· .. · J 1 1 li/ o ..e o () ro ro ..... en Q) ..... >. -~ "-' co > ; ~ Q) ... """ ro :'Q en o () en ·::;: J!! Q) """ o :.e E ro () m '- o o. ro E .Ñ e Q) ro Q) """ - e 00 •O r-(j) "ü ..-- () _.. ro Q) ro E (]) >. N """ e e w ·O E "ü ..e :0 o (]) 0:: 2 ¿.,¡ Q) e - e: :S Q) 0'1 :::J u.. u.. 30 Las enzimas típicas de pulpas, rebajan fuertemente la viscosidad al principio de la reacción. Las pectinasas para la clarificación y concentración de zumos, alcanzan con mayor rapidez el punto en el que por la prueba de alcohol ya no se detecta más pectina. F. ASPECTOS REOLÓGICOS DE PULPAS Y ZUMOS DE FRUTAS 1. Reología Es la ciencia de la deformación y flujo de la materia. Hay numerosas razones para que los datos reológicos sean necesarios en la industria de los alimentos: - Para ser utilizados en los cálculos de los procesos de ingeniería. Para determinar la fur:'cionalidad de ingredientes en el desarrollo de productos. Control de calidad. Evaluación de la textura correlacionado con el análisis sensorial (Steffe, 1992). 2. Viscosidad La viscosidad es la propiedad de un fluido que da lugar a fuerzas que se oponen al movimiento relativo de capas adyacentes en el fluido y son de carácter similar a las fuerzas cortantes de los sólidos (Geankoplis, 1995). 3. Tipos de fluidos alimenticios Los fluidos alimenticios pueden clasificarse en tiempos independientes 31 y tiempos dependientes (Steffe, 1992). Por otra parte se agrupa a los fluidos alimenticios en función a la ley de Newton de la Viscosidad en Newtonianos y no Newtonianos (Osorio, 1990). En los fluidos tiempo independiente el esfuerzo cortante no es función del tiempo o duración de la acción cortante (Brito, 1995). Entre estos fluidos tenemos: Fluido Newtoniano, Fluido pseudoplástico, Fluido dilatante, Fluido plástico de Bingham, Fluido pseudoplástico con umbral de fluencia, Fluido dilatante con umbral de fluencia (Barboza, 1993). a. Fluido newtoniano Son aquellos fluidos en la que la relación entre el esfuerzo de corte o cizalla y la velocidad de deformación o velocidad de corte siguen una relación lineal (Br.i.to, 1995). t =u (dv/dy) Donde t : Esfuerzo de corte o cizalla (Pa). u : Viscosidad dinámica o coeficiente de viscosidad (Pa. s). dv/dy: Gradiente de deformación o velocidad de corte (s-1). Los líquidos simples, pastas con bajo contenidos en sólidos presentan comportamiento ideal newtoniano. En este tipo de flujo se incluye a la mayoría de las bebidas como: té, café, cerveza, leche, aceite, zumo de naranja, zumo de manzana, vinos, bebidas gaseosas, etc. (Barboza, 1993). 32 b. Fluido pseudoplástico Este comportamiento es muy común en fluidos alimenticios. En muchos casos . este comportamiento no newtoniano puede ser atribuido a la presencia de sustancias de elevado peso molecular en solución y/o a la dispersión de sólidos en una fase fluida. Para los fluidos seudoplásticos el índice de comportamiento de flujo es menor que la unidad (Brito, 1995). 1: = m (dv/dy) n Donde: m: lndice de consistencia (Pa. s"). n: lndice de comportamiento de flujo (n<1). 111. MATERIALES Y MÉTODOS El presente trabajo de Investigación se desarrolló en el laboratorio de Análisis de Alimentos de la Universidad Nacional Agraria de la Selva y en los Laboratorios de Ciencia y Tecnología de la Universidad Privada Antenor Orrego, Trujillo. A . MATERIA PRIMA E INSUMOS 1. Materia prima Se utilizaron frutos de cocona (Solanum topiro), tipo amaroñado los cuales fueron adquiridos en el mercado minorista de la ciudad de Tingo María. 2. Enzima poligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15) Se le conoce como: Polygalacturonasa, poly- (1 ,4, d-D-galacturonoide) glyconohidrolase; E.C. 3.2.1.15. Una unidad de actividad enzimática de esta enzima libera un micromol de ácido galacturónico, a partir del ácido poligalacturónico por minuto, a pH 4,0 y a 25°C. Se presenta en solución en KCI y Sorbitol, presenta 31 mg de proteína/mi. por 11,8 unidades/mg de proteína y se codifica como P 9179 en la marca SIGMA. B. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS 1. Equipos de laboratorio Balanza semianalítica, marca Sartorius sensibilidad O, 1 gr. E~. U U. Balanza analítica electrónica - OHAUS Modelo AP 2103 serial • 34 # 113032314, sensibilidad 0,0001 gr. EE.UU. Baño María Memmert serie li-X-S, rango de temperatura oo a 95°C. Bomba de Vació (precisión Vacuum Pump) Model 535, CGA Coorporation USA. Congeladora Faeda. Estufa marca Memmert electric tipo LR-202. Espectrofotómetro molecular, modelo Espectronic 20, Rango de longitud de 325 a 940 nm. Potenciómetro rango O a 14 digital Marca HANNA. Pulpeadora o majador, marca Kamplex tipo Ep-9 con juego de tramices. Hungría. Refrigerador OLG. Refactómetro de mano, graduado de O a 100% de sacarosa. Viscómetro capilar a Cannon - Fenske, marca Kimax (USA). Viscómetro BROKFIELD LV. Brookfield Engineering Laboratories, lnc. soughton, USA. Vernier, marca SOLINGER, made in Germany. 2. Materiales de laboratorio Agitador de vidrio. Buretas de 25 y 50 mi c/u Cronómetro. Cuchillos de acero inoxidable. Embudos de vidrio y porcelana 35 Fiolas de 50, 100, 250 y 500 mi c/u. Kitasato de 250 mi Matraces de 100, 250 y 500 mi c/u. Papel filtro rápido. Papel filtro whattman No. 40-42. Pipetas de O, 1; 0,25; 0,5; 1 ,O; 2,0; 5,0; 10 mi c/u. Probetas de 10, 100 y 250 mi c/u. Pizetas. Te las para filtrado. Termómetros de -1 ooc a 250°C. Tubos de prueba. Vasos de precipitación de 50, 100, 250, 600 y 1000 mi c/u. 3. Reactivos y soluciones: __ . Ácido acético Ácido sulfúrico Acetato de sodio Acido clorhídrico Alcohol etílico al 96% de pureza. Almidón soluble. Acido Ascórbico. Acido poligalacturónico. Bisulfito de Sodio. Buffer acetato de Sodio O, 1 M, pH 4.5 Buffer acetato de Sodio 1 M, pH 5.0 36 Fenoltaleína al 1% Glucosa Anhidra Hidróxido de Sodio 1 N. Solución de Yodo 0,1 N. Tiosulfato de Sodio 5H20 Otros reactivos usados en los análisis físicos - químicos y microbiológicos. 4. Envases Se utilizaron botellas de vidrio de 180 mi de capacidad y tapas plásticas. C. MÉTODOS DE ANÁLISIS Los métodos de análisis que ~e emplearon en el desarrollo del trabajo de investigación se presentan a continuación: 1. Caracterización de la materia prima Se realizaron las siguientes determinaciones analíticas cualitativas y cuantitativas: a. Determinaciones Físicas Peso del fruto. Dimensiones de los frutos, se utilizó un vernier para medir longitud y diámetro (Shewfelt, 1993). b. Análisis químico próxima! Humedad, método 12.002 (AOAC, 1984). Proteína, método semimicro Kjeldahl, utilizando como factor de 37 conversión de nitrógeno a proteína 6,25 (AOAC, 1984). - Grasa, método 13.074 (AOAC, 1984). - Fibra bruta, método 962.09 (E.b) (AOAC, 1997). - Ceniza, método 940.26 (A) (AOAC, 1997). - Carbohidratos totales, se determinaron por diferencia, después de haber realizado los análisis anteriores ( AOAC, 1984; Hart y Fisher, 1994). c. Análisis físico-químico - Viscosidad aparente, método descrito por Steffe (1992) y Mitschka (1982). - pH, potenciometricamente a 20°C, método 11.032 (AOAC, 1984). - Sólidos solubles •. método refractométrico 932.14 (e ) (AOAC, 1997). - Sólidos totales, por diferencia del porcentaje de humedad. - Acidez titulable, método 942.15 (A,a) (AOAC, 1997). - lndice de Madurez, cociente de dividir los grados brix por la acidez titulable (Royo, 1977). - Vitamina C, método espectofotométrico propuesto por el Departamento de Agricultura del Canadá (1976). - Pectina, método cualitativo y cuantitativo (Rohm Enzyme, 1978, Rangana, 1979). - Azúcares reductores, totales; metódo espectrofotometrico (Miller, 1959). 38 2. Actividad enzimática de la poligalacturonasa (PG) y obtención de zumo. a. Actividad Enzimática Se determinó mediante el método lodimétrico (Neufeld et. al., 1968). Principio La enzima produce una hidrólisis al azar del ácido poligalacturónico dando origen a una mezcla de ácidos D- galacturónico y Di-galacturónico en una relación molar aproximada de 4:3, a este nivel el 70 por ciento de los enlaces del polímero lineal se encuentran hidrolizados. Se produce una hidrólisis lineal, durante la cual aproximadamente el 25 por ciento de los enlaces gluc9sídicos son hidrolizados después del cual la velocidad de reacción decae. El ensayo enzimático se basa en la medición de la velocidad inicial del incremento en grupos aldehídos los cuales están relacionados con la oxidación de hipoyodito, durante los primeros 3 a 5 por ciento de hidrólisis también hay un rápido descenso de la viscosidad de la solución del ácido poligalacturónico. Reactivos Enzima; se diluyó la enzima en concentraciones convenientes: O, 1 mi de enzima poligalacturonasa/5 mi de solución. Pectina; conocido como ácido poligalacturónico obtenido de naranja con una pureza de 86 por ciento, codificado como P3889 39 en fa marca SIGMA. Para preparar una solución de poligalacturonato de sodio al 0,5 por ciento se siguió los siguientes pasos: Suspender un gramo de ácido poligalacturónico en 150 mi de agua destilada, agregue 20 mi de buffer acetato de sodio 1 M a pH 5,0. Titular la solución a pH 5,0 con NaOH 1 N y ajustar el volumen a 200 mi, con agua destilada. Solución de Yodo, O, 1 N Procedimiento Llevar a 30°C 20 rn! de una solución de ácido poligalacturónico, adicionar 1 mi de la solución de enzima adecuadamente diluida, mezclar rápidamente y anotar el tiempo. Se toman 5 mi de la mezcla en reacción y se le adiciona 5 mi de la solución de yodo O, 1 N en un frasco erlenmeyer de 50 mi se anota el tiempo en el momento en que se adiciona la solución de yodo a la muestra. Se adiciona 0.9 mi de Na2C03, 1 M inmediatamente, la mezcla es dejada en reposo exactamente 20 min, luego es acidificada con 2 mi de HzS04, 2M y el yodo residual es titulado con NazS203, 0,1 N. Son tomados 2 ó 3 muestras adicionales a partir de la mezcla en reacción (aproximadamente cada 4 ó 5 minutos), el tiempo es registrado como en el caso anterior y son tratados similarmente. 40 Los valores de la titulación son plateados como una función del tiempo para determinar la pendiente de la recta obtenida. Un microequivalente de yodo reducido corresponde a 0,513 micromoles de grupos aldehídos liberados. La actividad de la enzima es calculada y expresada por mi ó mg. de proteína de la solución de enzima. Definición de la unidad enzimática La actividad de fa endo-pofygalacturonasa de levadura es fa cantidad de enzima que producirá un micromof de grupos aldehídos/minuto a 30°C y pH 5,0. Aunque el pH óptimo está entre 4,4 y 4,5 fa curva de actividad tiene un pico ancho y fa diferencia en la actividad es el desprecio, fa ventaja de usar pH 5,0 es que el ácido péctico de alto peso molecular es más soluble a pH 5,0 que en pH 4,0. b. Obtención del Zumo Tratamiento Enzimático; se realizó de acuerdo al método Novo (Madden, 1991). El tratamiento Enzimático de la pulpa de cocona en función de la concentración de enzima, temperatura y tiempo de hidrólisis fue evaluado teniéndose como parámetro el rendimiento de zumo. Además se determinó la estabilidad a fa sedimentación, las muestras de cada tratamiento se almacenaron en refrigeración, siendo observados después de 24 horas para evaluar fa presencia o ausencia de sedimentos (Madden, 1991 ). 41 3. Viscosidad de la Pulpa y del Zumo Análisis reológicos mediante el Viscosímetro Brookfield, Splindle tipo disco (Mitschka, 1982). Viscosidad del zumo, empleándose el Viscosímetro capilar Cannon Fenske No.150 (Lewis, 1993). 4. Caracterización del Zumo y Almacenamiento Se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: pH, acidez total, vitamina C, azúcares reductores, viscosidad, por los métodos descritos en C. 1, además de los siguientes análisis. Densidad, método pignómetro (Madrid, 1994). Transparencia, por espectrofometría (Versteeg, 1980). Los análisis físico-químico se realizaron cada 20 días {O, 20, 40 y 60 días); el análisis micro~iológico se realizó al inicio y al final del almacenamiento (tiempo de almacenamiento 2 meses) y el análisis sensorial al final del almacenamiento. D. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL A continuación se presentan las etapas del trabajo de investigación: 1. Índices de madurez y caracterización de la cocona. 2. Actividad enzimática de la Poligalacturonasa (PG) y obtención de zumo. 3. Aspectos reológicos de la pulpa y del zumo. 4. Caracterización del zumo y almacenamiento. 42 . 1. lndices de madurez y caracterización de la cocona Los índices de madurez se determinaron mediante los métodos de análisis físico químicos, evaluándose el pHo Brix, acidez titulable y variación del color de la cáscara (Shewfelt, 1993). a. En las determinaciones físicas, se evaluaron las características biométricas. b. El análisis químico próxima! de la pulpa de cocona madura consistió en: humedad, proteína, grasa, fibra, ceniza y carbohidratos. c. En el análisis físico-químico se determinó: o Brix, pH, acidez titulable, pectina, almidón, azúcares reductores y totales y vitamina C. Los métodos utilizados se indican en C.1. 2. Actividad enzimática de_la poligalacturonasa (PG) y obtención del zumo a. Actividad Enzimática de la Poligalacturonasa Se determinó la actividad enzimática de la Poligalacturonasa, teniendo en cuenta el método señalado en la sección de métodos de análisis, C.2. b. Obtención del Zumo 1. Acondicionamiento de la pulpa. El acondicionamiento de la pulpa de cocona se realizó siguiendo el flujo de operaciones descrito por Matos (1996) y tomando los parámetros mencionados por Manayay (1986); lo cual se muestra en la Figura 3. MATERIA PRIMA SELECCIÓN LAVADO ,¡,. PELADO ~ CORTADO Y DESEMILLADO PULPEADO - ,¡,. REFINADO ,¡,. PESADO ,,. ENVASADO ,,. CONGELADO Figura 3. Diagrama de Bloques para el acondicionamiento de la Pulpa de Cocona. 44 A continuación se describe cada operación que se indica en la figura anterior: Materia prima Se emplearon frutos maduros de cocona, de acuerdo a los criterios mencionados. Selección Se seleccionaron las frutas que se encontraron aptas para el proceso, teniendo en cuenta la sanidad. Lavado Se efectúo por inmersión y frotamiento en agua potable para quitar partículas extrañas de la superficie. Pelado Se realizó un pelado químico por inmersión en agua a ebullición con 2 por ciento de NaOH por 1 O minutos. Cortado y desemillado Se realizó de forma manual con cuchillos y cucharas de acero inoxidable. Pulpeado Se realizó en una pulpeadora con malla de 0,4 mm de diámetro lo que nos permitió obtener una pulpa fina. Refinado Se realizó en el molino coloidal con 0,25 mm de luz, para obtener una pulpa libre de restos fibrosos. 45 Pesado Se realizó para acondicionar 800 g de pulpa de cocona, los cuales fueron utilizados en cada día de trabajo. Envasado Se realizó en bolsa de polietileno de alta densidad. Congelado La pulpa se congeló a -18°C durante el período que se realizaron las pruebas experimentales. 2. Tratamiento Enzimático Se realizó variando fa concentración de enzima, la temperatura y el tiempo de hidrólisis, así como se muestra en fa Figura 5 y evaluándose el rendimiento de zumo, mediante un tiempo de filtrado de 15 minutos (Madden, 1991 ). La prueba para determinar fa presencia de pectina y almidón se trabajó con la concentración de enzima, temperatura y tiempo de hidrólisis óptimo. 3. Obtención del Zumo Se realizó de acuerdo al flujograma de la Figura 4. Pulpa acondicionada Se utilizó fa pulpa de cocona acondicionada de acuerdo al Diagrama de Flujo de la Figura 3. Hidrólisis enzimática La pulpa fue tratada con la dosis óptima de Poligalacturonasa '·· determinada anteriormente, con la finalidad de hidrolizar fa 46 pectina presente en la pulpa y obtener un mayor rendimiento de zumo. lnactivación enzimática Se hizo a 90° C/ 60 s, para que no exista presencia de enzima en el zumo obtenido (Verstech, 1980; Ben-Shalom, 1986). Prensado Se realizó utilizando una prensa manual, con la finalidad de obtener mayor rendimiento de zumo. Centrifugación Se realizó a 5000 rpm/15 min, con la finalidad de eliminar las partículas en suspensión y clarificar (Viquez, 1981). Pasteurización Se pasteurizó a ,~5°C/60 s para lograr la asepcia del producto, luego se añade O, 05 por ciento de sorbato de potasio como preservante (lndecopi, 1976). El pH de la pulpa se encontró en 3.9 por lo que no fue necesario corregirlo. Envasado y coronado Se envasaron en caliente siendo inmediatamente sellados para generar vació en las botellas (Cheftel, 1980). Enfriado Se enfriaron las botellas por inmersión en agua potable hasta alcanzar una temperatura de 38° C, que facilita el secado de la superficie de la botella. 47 Almacenado El zumo se almacenó por 60 días a temperaturas de refrigeración a 4° C y ambiente a 25° C, realizándose los análisis , físico-químicos cada 20 días y el análisis microbiológico al inicio y al final del almacenamiento. PULPA ACONDICIONADA ,¡,. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA t INACTIVACIÓN ENZIMÁTICA ~ PRENSADO CENTRIFUGADO ,,.. PASTEURIZADO ,,.. ENVASADO CORONADO ' ENFRIADO ALMACENADO Figura 4. Diagrama de Bloques definitivo para la obtención de zumo de cocona mediante hidrólisis enzimática de la pulpa. --. 49 3. Aspectos reológicos de la pulpa y del zumo Se determinó el comportamiento reológico de la pulpa de cocona y de igual manera de la pulpa acondicionada a la temperatura de 30°C; antes del tratamiento enzimático y después del tratamiento enzimático. Para estas pruebas se utilizó el Viscosímetro Brookfield con el spindle N°. 3. Se evaluó la variación de la viscosidad (cP) a la temperatura óptima durante el tratamiento enzimático. Se evalúo la viscosidad del zumo obtenido empleándose el . Viscosímetro capilar Cannon Fenske (Lewis, 1993). 4. Caracterización del zumo y almacenamiento a. Análisis físico-químico del zumo de cocona. El zumo de cocon9 fue caracterizado teniendo en cuenta la determinación de: acidez total, vitamina C, azúcares reductores, azúcares totales y viscosidad. Las evaluaciones en el almacenamiento a temperaturas de refrigeración de 4° C y ambiente de 25° C, se realizaron cada 20 días/60 días. b. Análisis microbiológico Se realizaron siguiendo los métodos de análisis recomendados por la ICMSF (1983). Se realizaron los índices de numeración de microorganismos aerobios viables mesófilos (NMAVM), Numeración de lactobacillus y Numeración de mohos y levaduras. 50 c. Evaluación sensorial Se tomó como base las características principales usando los atributos de sabor, color y aroma para lo cual se utilizaron una escala hedónica de 9 puntos, los resultados de cada panelista fueron sumados obteniéndose el promedio con el cual se establece la calificación (Anzaldua, 1994). E. DISEÑO EXPERIMENTAL 1. Tratamiento Enzimático El diseño experimental se presenta esquemáticamente en la Figura 5, el cual fue estructurado de tal forma que permite la evaluación de la acción enzimática. Este diseño muestra detalles de las variables en estudio, explicándose el significad~, de cada variable. El mejor tratamiento se determinó teniendo en cuenta el rendimiento de zumo (Rohm Enzyme, 1980), para lo cual los valores experimentales fueron evaluados estadísticamente. F. ANALISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico para el diseño experimental de la Figura 5, se adecua a un diseño bloque completo al azar (DBCA) con arreglo factorial de 3A x 38 x 3C con 2 repeticiones (Daniel, 1996). la significación estadística sé evaluó con la prueba de Tukey para comparación de medias múltiples al 5 por ciento de probabilidad de significancia seleccionándose el mejor tratamiento, posteriormente a este 51 tratamiento se le aplicó un diseño completo al azar con dos repeticiones para determinar la mejor concentración de enzima. PULPA ACONDICIONADA LEYENDA TRATAMIENTO SELECCIONADO (Con 2 repeticiones) A: Concentración de enzima PG ( v/p ) A1 : 0,01% A2 : 0,03% ~ t- -t-- · --r --1 A3 : 0,05% 8 : Temperatura 8, : 40° e 82 : sao e 83 : 60° e E1 E2 Ea E4 t * t t ¡ C : Tiempo de hidrólisis e, : 60 min TRATAMIENTO SELECCIONADO (Con 2 repeticiones) c2 : 90 min c3 : 120 min E : Enzima Poligalacturonasa E1 : 0,02% E2 : 0,03% E3 : 0,04% E4 : 0,05% Figura 5. Diagrama del diseño experimental para el tratamiento enzimático IV.- RESULTADOS Y DISCUSIONES A. INDICES DE MADUREZ Y CARACTERIZACIÓN DE COCONA SELECCIONADA 1.- lndice de madurez En la tabla 3, se presentan los resultados de las evaluaciones realizadas en muestras de cocona (Solanum topiro), durante el desarrollo de la madurez comercial. Tabla 3. Características de cinco grados de madurez de cocona tipo amaroñado. CARACTERÍSTICAS GM Humedad 0 8rix 1 88.68 3.3 2 91.69 3.6 3 92.43 4.8 4 92.78 5.5 5 93.09 5.0 Fuente: propia Donde: GM :Grado de Madurez IM :Índice de Madurez 1 :100% verde Pulpa 1 . Acidez cáscara Titulable 1.55 0.92 1.68 0.95 1.84 0.93 2.10 0.92 2.26 0.89 pH IM 3.96 3.6 3.52 3.8 3.78 5.2 3.86 6.2 4.10 5.6 '· 54 2 : 80% verde, 20% amarillo 3 :50% verde, 50% amarillo 4 :100% amarillo (maduro) 5 :Sobre maduro. De la tabla anterior se puede observar que el contenido de humedad, los sólidos solubles y la relación pulpa 1 cáscara, presentan contenidos que se incrementan conforme transcurre la maduración, alcanzando una humedad de 93,09 por ciento; 5,8 oBrix y una relación pulpa 1 cáscara de 2,26. Estos resultados se expresan gráficamente en las figuras 6, 7 y 8. El incremento de los sólidos solubles durante la maduración comercial, está relacionado con la_. transformación del almidón en azúcares, decayendo el contenido desde 20 a 25 por ciento en la fruta verde a 0,2 a 1,5 por ciento en la fruta madura; produciéndose un aumento creciente del dulzor en la fruta madura (Chitarra, 1990). En la tabla 3 se puede apreciar que el contenido de sólidos solubles es mayor cuando la cocona se encuentra madura, observando también que en el sobre maduro disminuye, debido a que los azúcares empiezan a fermentarse; debido a estas características se seleccionó la cocona con un índice de madurez de 6,0 para la utilización en la obtención de zumo. Los resultados de las evaluaciones de pH indican que se produce un aumento en la concentración de ácidos ionizables, lo que conduce a 55 una disminución en el valor del pH de 3,96 a 3,52 y luego se increme.hta hasta 4,1 O como se muestra en la Figura 9. La acidez titulable de la pulpa también se puede observar en la tabla 3 que aumenta conforme transcurre la maduración, llegando a un contenido a máximo de 0,95 por ciento de ácido cítrico, para luego empezar a descender, la variación se muestra en la Figura 10. Este comportamiento coincide con la mayoría de las frutas tropicales, donde el contenido de ácidos disminuye después de la cosecha (Monteiro, 1993). En el Anexo 1 , se muestran las ecuaciones que se utilizaron para ajustar los datos experimentales de las Figuras 6-10. 94 93 - 92 ~ o - 91 "C ns 90 "C Q) 89 E ::S 88 :X: 87 86 6.0 5.0 >< 4.0 ·r= .D. en 3.0 o "C ns 2.0 lo. (!) 1.0 0.0 1 2 3 o Experimental -Estimado 4 5 Grado de madurez Figura 6. Variación del contenido de humedad -,----------------------------·--------- - . "11 erimental mado .... ······- .. . .. --------· -------····---------·- 1 2 3 4 5 Grado de madurez Figura 7. Variación del contenido de sólidos solubles 2.50 E 2.oo ns (.) U> 1.50 •CO (.) -ns 1.00 o. -:S Q. 0.50 [ e Experimental 1 -Estimado 0.00 +--------,.-----,-----.------.,--------1 1 2 3 4 5 Grado de madurez Figura 8. Variación de la relación pulpa 1 cáscara 4.20 ....------·----·-----·--·------------· 4.00 3.80 :X: o. 3.60 Cl 3.40 3.20 1 2 3 4 5 Grado de madurez Figura 9. Variación del pH 0.96 0.95 o -~ o 0.94 -~ .e 0.93 10 ::::1 0.92 ..... ~ N 0.91 <1> "C 0.90 '(3 < 0.89 0.88 2 3 4 5 Grado de madurez Figura 10. Variación de la acidez titulable 59 2. Caracterización dela cocona a. Determinaciones Físicas Para las determinaciones físicas se utilizó coconas maduras las cuales fueron adquiridas en el mercado de abastos de Tingo María. Características biométricas En la tabla 4, se muestra los resultados obtenidos en la determinación de las medidas biométricas de los frutos de cocona. Tabla 4. Medidas biométricas promedio de la cocona tipoamaroñado. CARACTERÍSTICAS Longitud (mm) Peso (g) Diámetro (mm) Promedio (*) Valormax. Valor min. Fuente: propia 82,06 84,90 79,55 * Promedio de 20 frutos maduros. 130 68,15 140 70,46 110 55,18 Las medias biométricas son específicas para cada tipo, en la tabla anterior se observa que existen valores máximas y mínimas en cuanto a longitud, diámetro y peso. Estos valores no se pueden comparar con otros tipos de cocona ya que cada uno de ellos presenta tamaños y formas diferentes. Se sabe que el peso promedio del fruto es de 150 g en general sin especificar el tipo 60 (Calzada, 1980); en este caso el peso promedio es de 130 g. b. Análisis químico próxima! Los resultados del análisis químico próxima! de la cocona se muestra en el tabla 5. Tabla 5. Análisis químico próxima! de cocona madura. COMPONENTES % Humedad 92,78 Proteína (N x 6,25) 1,74 Grasa 0,21 Fibra 0,69 Ceniza 0,38 Carbohidratos 4,20 Fu ente propia Los resultados del tabla 5, son similares a los reportados por Carmona (1990), los cuales dependen del grado de madurez, clima y suelo entre otros factores. Además podemos observar que los componentes que más destacan son la humedad con 92,78 por ciento y el contenido de carbohidratos con 4,20 por ciento. c. Análisis físico químico de la cocona La tabla 6, nos muestra los resultados del análisis físico químico de la cocona con respecto a la parte comestible. Referente a los azúcares reductores Manayay (1986) y Carmona 61 (1990), reportan valores de 1,10 por ciento y 1,30 por ciento respectivamente, estos valores difieren de los encontrados en nuestros resultados pudiendo atribuirse al grado de madurez, tipo de cocona entre otros factores. Es importante resaltar también que la interacción de proteínas o aminas con carbohidratos (azúcares reductores), van a producir los pardeamientos no oxidativos como son los fenómenos de caram,elización y reacción de Maillard respectivamente (Fennema, 1993). Tabla 6. Características físico-químicas de la Cocona en 100 g de parte comestible. COMPONENTES Humedad Sólidos Totales Sólidos Solubles (0 8rix) pH Ácidez titulable (Ac. Cítrico). Índice de Madurez Vitamina C. Pectina Azúcares Reductores Azúcares Totales Viscosidad Fuente: propia RESULTADOS 92,78% 7,22% 5,50 3,86 0,92% 6,00 2,90% 1,01% 1,93% 3,78% 3791,00cP 62 B. ACTIVIDAD ENZIMÁ TI CA DE LA POLIGALACTURONASA (PG) Y OBTENCIÓN DEL ZUMO 1. ACTIVIDAD ENZIMÁ TI CA. La actividad de la Poligalacturonasa (PG), se determinó según lo descrito en C.2 de la parte de métodos de análisis. Los datos numéricos se muestran en la tabla 7. Tabla 7. Resultados experimentales para la determinación de la actividad enzimática de Poligalacturonasa (PG) [E]: O, 1 mi PG/5 mi Tiempo # moles de grupos minutos aldehídos 0,0 0,000 5,0 9,747 *10,0 14,621 15,0 18,058 20,0 20,469 Fuente: propia *· Número de puntos experimentales utilizados para obtener la ecuación para este caso. Se determinó la actividad de la Poligalacturonasa utilizando como sustrato una solución de ácido poligalacturónico al 0,5 por ciento , en buffer acetato de sodio 1 M; pH 5,0 y a 30°C; determinándose una actividad pectolítica de 292 ¡..tmoles de grupos aldehídos por mi de enzima original/ minuto ó 292 U 1 mi. 63 Sigma reporta una actividad de 366 U/mi. para esta enzima, la cual expresa la cantidad de enzima que libera 1 mol de ácido galacturónico a partir del ácido poligalacturónico por minuto a pH 4 y a 25° C (Neufeld et. al., 1968). Ambos resultados teórico y práctico son determinados utilizando el mismo sustrato, ácido poligalacturónico; pero a otras condiciones de pH y temperatura, ya que el ácido péctico de peso molecular alto es más soluble a pH 5,0 para el método lodimétrico. Rohm (1978), menciona que las pectinasas almacenadas en un lugar fresco (aprox. 4°C), experimenta pérdida de actividad al cabo de un año de 5-10 por ciento. En la Figura 11, se muestra la curva de los datos experimentales los cuales expresan la varia_ción del número de micromoles de grupos aldehídos vs. el tiempo en minutos de acción enzimática. Mediante el análisis de regresión lineal de la porción recta de la curva, se determinó la actividad enzimática pectolítica que viene representado por la respectiva pendiente, la ecuación representativa se muestra en la Figura. 11. tn o "C ·- .J: Q) "C -cu tn Q) -o E :t. =lt: 25 ------------------·--·------··----------~-------------------- 20 15 10 5 y= 1.4621x + 0.8122 ~ = 0.9643 o o -1----EI--~,------,- o 5 10 Tiempo (min) ·-----------------·-------·-] o Experimental -Estimado -----·--"---~--- 15 20 Figura 11. Actividad enzimática de la poligalacturonasa (PG) 65 2. OBTENCIÓN DEL ZUMO a. Acondicionamiento de la Pulpa La pulpa de cocona fue condicionada tal como se indica en el flujograma de la Figura 12. Donde se puede apreciar un rendimiento de 67,73 por ciento existiendo una pérdida de 8,12 por ciento en el pelado y de 24,15 por ciento en el pulpeado. b. Tratamiento enzimático de la pulpa El tratamiento enzimático se realizó con la enzima Poligalacturonasa (PG) y utilizando 100 g de sustrato (Pulpa de cocona) por cada tratamiento y variando parámetros de temperatura C C), tiempo de hidrólisis (min.) y concentración de enzima (E), resultados que se muestran en la tabla 8. En esta tabla se .presentan resultados de zumo extraído en volumen y peso; apreciándose que el efecto de la enzima es mayor conforme aumenta la concentración y temperatura; de igual manera el rendimiento de zumo aumenta conforme aumenta el tiempo de hidrólisis. Además las muestras testigos (Blanco) presentan un rendimiento promedio de 12 mi de zumo. MATERIA PRIMA f PESADO 100% ~ LAVADO ,¡, PELADO 91.88% ,,.. CORTADO Y DESEMILLADO Y REFINADO 67.73% PESADO 67.73% if ENVASADO 67.73% ALMACENADO -18°C 67.73% Figura 12. Diagrama de bloques para el acondicionamiento de la pulpa de cocona. Tabla 8. Rendimiento de zumo extraído por acción enzimática de la PG sobre la pulpa (*). A B e Rendimiento del Zumo Enzima Temperatura Tiempo Volumen Peso Observa- (%) {oC) (m in) (mi) (g) ciones 0,01 40 60 26,5 26,18 --+ 0,01 40 90 34,8 34,38 --+ 0,01 40 120 36,8 36,36 -++ 0,01 50 60 33,4 33,00 --+ 0,01 50 90 39,8 39,32 -++ 0,01 50 120 39,9 39,42 -++ 0,01 60 60 21,7 21,44 --+ 0,01 60 90 28,2 27,86 --+ 0,01 60 120 28,7 28,36 --+ 0,03 40 60 33,4 33,00 --+ 0,03 40 90 42,8 42,29 -++ 0,03 40 120 42,9 42,39 -++ 0,03 50 60 42,2 41,69 -++ 0,03 50 90 48,5 47,92 +++ 0,03 50 120 48,6 48,02 +++ 0,03 60 60 31,4 31,02 --+ 0,03 60 90 34,2 33,79 --+ 0,03 60 120 36,1 35,67 --+ 0,05 40 60 32,4 32,01 --+ 0,05 . 40 90 42,5 41,99 +++ 0,05 40 120 44,8 44,26 -++ 0,05 50 60 45,3 44,76 -++ 0,05 50 90 48,8 48,21 +++ 0,05 50 120 48,9 48,31 +++ 0,05 60 60 32,9 32,51 --+ 0,05 60 90 34,4 33,99 --+ 0,05 60 120 36,9 36,46 -++ Fuente: propia (*) : Promedio de dos repeticiones --- : inestable, alta sedimentación --+ : inestable, regular sedimentación -++: poco estable, poca sedimentación +++:estable, muy poca sedimentación. Tabla 9. 68 Como se menciona antes el testigo presento un rendimiento promedio de 12 mi de zumo y si comparamos este resultado con los obtenidos en la tabla 8 podremos observar la importancia ·de los enzimas pectolíticas en la tecnología moderna de los jugos de frutas, así como la contribución de las enzimas para un procesamiento rápido, para mayor rendimiento y asegurar la mejor calidad posible del producto terminado (Novo, 1986). Los resultados de la tabla anterior fueron analizados estadísticamente mediante un diseño bloque completo al Azar con arreglo factorial 3A x 38 x 3C con 2 repeticiones, el análisis de varianza se muestra en la tabla 9. Análisis de Varianza para el rendimiento de zumo extraído, por acción de la Poligalacturonasa. Sum. Cuad. CM Fe F F.V. g.l. Sig. 5% 1% BLOQUE 2.7518 1 2.7518 651.6541 4.225 7.721 ** TRATAMIENTO 2793.8553 26 107.4560 25446.6631 1.929 2.554 A (o/o de enzima) 800.2395 2 400.1198 94752.4105 3.369 5.526 ** B (Temp.) 1351.3124 2 675.6562 160002.2333 3.369 5.526 ** C (Tiempo) 530.1292 2 265.0646 62769.9827 3.369 5.526 ** INTERACCIONES AB 11.643563 4 2.9109 689.3284 2.743 4.140 AC 6.917607 4 1.7294 408.5399 2.743 4.140 ** BC 73.962363 4 18.4906 4378.7592 2.743 4.140 ** ABC 19.650659 8 2.4563 581.6844 2.321 3.288 ** ERROR 0.1097926 26 0.0042 TOTAL (CORRECTED)· 2796.7092 53 Fuente: propia : '• C.V.= 19.41% RESPUESTA DE PROMEDIO= 37.434 69 De la tabla 9, según los valores de ANAVA, al nivel de 5 por ciento y 1 por ciento de probabilidad, se pudo observar que existe una alta significancia estadística para todos los factores (Concentración de enzima, A; Temperatura, B; Tiempo de hidrólisis, C) y entre tratamiento, es decir los promedios de las evaluaciones entre los tratamientos Indicando también la existencia de diferencia estadística entre los bloques (repeticiones) e interacciones AB, AC, BC y ABC. Se realizó la prueba de Tukey, presentándose los resultados en la tabla 10. Tabla 10. Promedios ordenados de la prueba de Tukey al 95% de Confianza para el rendimiento de zumo. FACTORES A B e ([ 1 Enzima) (Te m pera tu ra) (Tiempo) A - Sig. B - Sig. e - Sig. X X X 1 a1 32.01 a b3 31.42 a c1 33.05 a 2 a2 39.77 b b1 37.21 b c2 39.10 b 3 a3 40.52 b b2 43.67 e C3 40.16 b Fuente: propia Como podemos observar en la tabla 1 O, el factor A en sus niveles a2 (0,3 mi de enzima /Kg de pulpa) y a3 (0,5 mi de enzima /Kg de 70 pulpa) muestran mayor rendimiento superando estadísticamente al nivel a1 (O, 1 mi de enzima/Kg de pulpa); el factor 8 en su nivel b2 (50° C) muestra en mayor rendimiento superando a los niveles b1 (40° C) y b3 (60° C): de igual forma el factor e en sus niveles Cz (90 minutos) y c3 (120 minutos) no muestran diferencia, presentando ambos mayor rendimiento que el nivel c1 (60 minutos). Estos resultados concuerdan con lo reportado por Díaz (1991), quien encontró que los rendimientos en la extracción de jugo de maracuyá, se incrementan a medida que se incrementa la concentración de enzima, tiempo de hidrólisis e incluso la temperatura de incubación. Los tratamientos enzimáticos de la pulpa antes del prensado, son necesarios para la extracción de jugos de frutas ricas en pectinas. Las pectinas podrían dar origen a una masa semigelificada que dificulta la extracción de jugo y es así que las enzimas pectolíticas degradan esta estructura gelificada y facilitan la extracción. Además de mejorar, favorece la extracción de pigmentos, sabores y aromas, mejorando así las características organolépticas del zumo (Campos 1994 ). De acuerdo a la prueba de Tukey, las concentraciones de 0,03 por ciento y 0,05 por ciento son estadísticamente iguales; al igual que los tiempos de 90 y 120 min y la temperatura de 50°C. resultó la mejor estadísticamente ya que se obtuvo un mayor promedio 71 de rendimiento. Debido a ello se decidió seleccionar como tiempo óptimo 90 min, ya que al aplicar más tiempo no vamos a obtener mayor rendimiento. La Temperatura seleccionada fue de 50°C. Con el fin de seleccionar la concentración de enzima más adecuada se realizó otra prueba, variando la concentración desde 0,02 por ciento a 0,05 por ciento con un incremento de 0,01 por ciento a 50°C 1 90 min., los resultados se muestran en la tabla 11. Los rendimientos obtenidos como zumo turbio, fueron analizados estadísticamente, mediante un DCA presentándose el análisis de varianza en el Anexo 2; el cual indicó diferencia altamente significativa, razón por la cual se aplicó la prueba de Tukey con un a= 0,05 determinándose que el mejor tratamiento fue cuando se utilizó concentraciones desde 0,03 por ciento a 0,05 por ciento; demostrándole lo mismo en la prueba de pectina y de yodo (Tabla 12). De acuerdo a estos resultados se decidió tomar la concentración de 0,03 por ciento, considerándose de que estos resultados están dentro de lo recomendado, 0,01 por ciento -0,03 por ciento (Rohm Enzyme, 1978; Quest, 1995). Tabla 11. Rendimientos de zumo de pulpa de cocona, empleando diferentes concentraciones de enzima PG a 50°C y 90 min. ENZIMA Volumen Peso del Rendimiento Diferencia en el (%) Extraído (mi.) Zumo (g) (%) Rendimiento(%) 0,02 76,3 75,38 75,38 -9,29 0,03 84,40 83,39 83,39 -1,28 0,04 84,90 83,88 83,88 -0,79 0,05 85,70 84,67 84,67 0,00 Fuente: propia (*) Promedio de 2 repeticiones. Tabla 12. Resultados de la prueba de pectina y almidón. ENZIMA(%) 0,02 0,03 0,04 0,05 Fuente: propia Prueba de Yodo (Almidón) + +: Presencia de pectina y almidón. -. Ausencia de pectina y almidón. Prueba de Despectinación (Pectina) + 73 c. Diagrama de flujo final y balance de materia Para la obtención de zumo se utilizaron los parámetros que produjeron mayor rendimiento de zumo durante el tratamiento enzimático, los cuales fueron: Poligalacturonasa (E.C.3.2.1.15) al 0,03 por ciento (0,03 ml/100 g de pulpa), durante 90 minutos y a 50°C. Además se tuvo en cuenta la prueba de yodo y despectinación. Seleccionándose de esta manera el tratamiento que produjo el zumo más estable, con un rendimiento por prensado de 83,39 por ciento y 78,86 por ciento por centrifugación. Este rendimiento esta expresado en pulpa de cocona y peso de zumo (p/p). 1 ). Diagrama de Flujo y Balance de Materia En la Figura 13, se muestran las operaciones y el balance de materia a partir de pulpa acondicionada para la obtención de zumo de cocona por hidrólisis enzimática de la pulpa; con sus respectivos parámetros tecnológicos en cada operación. El balance de materia que se muestra en base a 1 00 Kg de pulpa acondicionada donde se observa que la mayor pérdida se produjo en el prensado, obteniéndose un rendimiento en zumo de 78,86 por ciento. PULPA ACONDICIONADA 100% HIDRÓLISIS ENZIMÁ TICA 100% INACTIVACIÓN ENZIMÁTICA 100% PRENSADO 83.39% CENTRIFUGACIÓN 78.86% PASTEURIZACIÓN 78.86% ENVASADO 78.86% CORONADO 78.86% ENFRIADO 78.86% ALMACENADO Enzima PG0,03% (v/p) T = 50° C /90 min Con prensa Manual. 5000 rpm/15 min .. Sorbato de Potasio 0,05% pH=3,8 85°C/s Envases de 180 mi. Figura 13. Diagrama de bloques para la obtención de zumo de cocona, mediante hidrólisis enzimática de la pulpa 75 Rendimiento En la tabla 13, se muestran los rendimientos obtenidos por cada operación, teniendo como base 100 Kg de materia prima, el menor rendimiento por operación se obtuvo durante el cortado, desemillado y refinado seguido del prensado 83,39 por ciento. Cheftel (1980) y Díaz (1991), reportan rendimientos en jugos mayores de 60% después de hidrolizar pulpas de frutas con enzimas pectolíticas. Viquez (1979) citado por Soto (1992); reporta que utilizando enzimas pectolíticas se han obtenido los mayores rendimientos 60 por ciento sobre el peso de la pulpa y de 35-45 por ciento sobre el peso de la fruta entera, el rendimiento que se obtuvo después de la centrifugación fue de 78,86 por ciento que es mayor al 60 por ciento indicado en la bibliografía y el rendimiento en función de la cocona entera fue de 53,92 por ciento. Tabla 13. Balance de materia y rendimiento por operación durante la obtención de zumo de colcona, sobre la base de 100 Kg. Materia que Materia Materia Rendimiento OPERACIONES Ingresa que Sale que por (Kg.) (Kg.) Continua Operación (Kg.) (%) Pesado 100,000 100,00 100,00 Selección 100,000 100,00 100,00 Lavado 100,000 100,00 100,00 Pelado 100,000 8.12 91.88 91,88 Cortado, Desemillado y Refinado. 91.88 24.15 67,73 77,72 Hidrólisis Enzimática 67.73 67,73 100,00 •' lnactivación Enzimática 67.73 67,73 100,00 Prensado 67.73 11.25 56,48 83,39 Centrifugado 56.48 2.56 53,92 95,47 Pasteurizado 53.92 53,92 100,00 Envasado 53.92 53.92 100,00 Coronado 53.92 53,92 100,00 Enfriado 53.92 53,92 100,00 Almacenado 53.92 53,92 100,00 Fuente: propia 77 C. ASPECTOS REOLÓGICOS DE LA PULPA DE COCONA La Figura 14, muestra la variación de la viscosidad durante el tratamiento enzimático a 50°C y a 0,03 por ciento de enzima, pudiéndose apreciar que ésta disminuyó conforme transcurrió el tiempo, observándose este comportamiento cuando se trabaja a velocidades de 5 rpm presentando una viscosidad inicial de 6887 cP, llegando hasta 1440 cP después del tratamiento enzimático (Anexo 3). En la Figura 15, se presentan los diagramas reológicos de la pulpa de cocona antes y después del tratamiento enzimático ambos a 30°C; cuyos resultados se muestran en el anexo 4. En la Figura 15, se observa que la pulpa después del tratamiento enzimático requiere un menor esfuerzo de corte, esto está relacionado con el rompimiento de las cadenas de pectinas, las que inicialmente forman con los agregados de pulpas una estructura reticular, que al romperse producen que la pulpa se disgregue en partículas más pequeñas con menor capacidad para ligar agua, provocando así la pérdida de la plasticidad y de la consistencia del producto (Carbonell, 1990). 7000 6000 -c.. 5000 () - 'O 4000 t'IS 'O ti) 3000 o () ti) 2000 > 1000 o 90 - 80 ~ - 70 G> ~ 60 o o 50 G> 'O 40 o t:! 30 G> :S 20 - ti) w 10 o o 15 30 45 60 Tiempo (min) -+-s RPM -10 RPM __._20 RPM -*-50 RPM . .. ·- ---·-··· ------------ ---------· --- 75 90 Figura 14. Variación de la viscosidad de la pulpa de cocona, por acción de la poligalacturonasa (PG) -,-----------------·· • • • • • • • • • 0.09 0.18 0.36 0.45 0.9 1.8 3.6 9 18 dv/dy (1/seg) Figura 15. Diagrama reológico de la pulpa de cocona antes y después del tratamiento enzimático 79 D. CARACTERIZACIÓN DEL ZUMO Y ALMACENAMIENTO Se almacenaron durante 60 días, realizando evaluaciones cada 20 días, los resultados de los análisis físico-químico, análisis sensorial y microbiológico se muestran en las tablas 14, 15 y 16. 1. Análisis Físico-Químico En la tabla 14, se observa que el pH y la acidez total no experimentan cambios significativos tanto en las muestras almacenadas en refrigeración como los almacenados a temperatura ambiente. Se observa que el contenido de vitamina C, experimenta una notable disr:ninución durante el almacenamiento, encontrándose al final del almacenamiento tan solo trazas. Se sabe que el ácido ascórbico es muy débil e inestable y puede ser degradado por muchas··'vías, siendo la oxidación y la degradación térmica los más importante (Badui, 1984). La estabilidad del ácido ascórbico aumenta a medida que disminuye la temperatura; también se aprecia que los azúcares reductores y totales experimentan un ligero incremento, pero mayor en el zumo almacenado a temperatura ambiente, esto es debido a la hidrólisis de los almidones presentes en el zumo, así como en la inversión de la sacarosa, mediante el cual el disacárido se hidroliza bajo la acción de los ácidos débiles en sus componentes fructosa y glucosa, {Fennema, .· 1993). Así mismo Cheftel (1980), manifiesta que la sacarosa sufre un proceso de hidrólisis lo que está favorecido por el pH ácido, la temperatura y el tiempo, produciéndose durante el almacenamiento. Tabla 14. Análisis Físico-químico del zumo de cocona durante el almacenamiento. COMPONENTES Temperatura OlAS. (oc) o 20 40 60 pH A 3,64 3,64 3,65 3,64 R 3,64 3,65 3,66 3,64 Acidez Titulable A 0,93 0,93 0,93 0,92 R 0,93 0,92 0,91 0,91 Vitamina C. A 1 '11 0,17 Trazas Trazas R 1 '11 0,45 Trazas Trazas . Azúcares Reductores A 18,60 19,41 20,28 21,05 R 18,60 18,78 19,31 19;81 Azúcares Totales A 37,70 39,52 41,23 43,10 R 35,70 37,93 39,53 40,27 Viscosidad A 0,7630 0,7630 0,7630 0,7630 R 0,7630 0,7630 0,7630 0,7630 Sólidos Solubles A 13,0 12,8 12,8 13,0 R 13,0 12,8 12,6 12,6 Densidad 0,988 Fuente: propia R: Temperatura de Refrigeración, 4° C. A: Temperatura Ambiente, 25° C. 81 Respecto a la viscosidad se puede apreciar que no muestra cambio alguno, durante el almacenamiento; lo cual indica que no hay presencia de enzima residual (quedó inhibida durante el tratamiento térmico). 2. Análisis Sensorial El resultado de evaluación sensorial se realizó después de 60 días de almacenamiento, donde se observa que el zumo de cocona tiene el siguiente calificativo para los siguientes atributos: sabor, aroma y color. Tabla 15. Resultados de la Evaluación sensorial del Zumo de Cocona, almacenado 60 días. Atributos Puntajes (Promedio) Sabor Aroma Color Fuente: propia A R 6,88 6,65 7,56 7,15 7,28 8,58 R: temperatura de la refrigeración, 4°C. A: Temperatura ambiente, 25°C. Calificativo A R Aceptable Bueno Aceptable Bueno Amarillo opaco Amarillo Claro Estos resultados fueron calificados mediante una escala hedónica de 9 puntos y con 15 panelistas semientrenados para ambas muestras; a refrigeración y ambiente. Según los Puntajes promedios para sabor y aroma para las muestras almacenadas a refrigeración pres~ntan un calificativo de bueno mientras que las muestras almacenadas a 82 temperatura ambiente presentan un calificativo de aceptable a bueno, de esto podemos decir que el mejor tratamiento fue el almacenado a temperatura de refrigeración ( 4 o e). Para el caso del color los almacenados a temperatura ambiente presentan un color amarillo opaco y los alma~nado en refrigeración un color amarillo claro. 3. Análisis Microbiológico En la tabla 15, se muestran los resultados del análisis microbiológico, donde se observa que el zumo almacenado a ambas temperaturas, no presentó presencia de bacterias aerobios viables, lactobacillus, mohos y levaduras. Lo que confirma la efectividad del pasteurizado, la acción del preservante (sorbato de potasio) y la hermeticidad del envase que no permitió la contaminación; aunque Mossell (1985), asegura que es frecuente encontrar mohos y levaduras en zumos de frutas. Tabla 16. Análisis microbiológico del zumo de cocona durante el almacenamiento. Temperatura OlAS (oC) o 60 DETERMINACIONES Numeración de Bacterias Aerobias A Ausencia/mi Ausencia/mi Viables R Ausencia/mi Ausencia/mi A Ausencia/mi Ausencia/mi Numeración de lactobacillus R Ausencia/mi Ausencia/mi A Ausencia/mi Ausencia/mi Numeración de Mohos y Levaduras R Ausencia/mi Ausencia/mi Fuente: propia A Temperatura Ambiente, 25°C. R Temperatura de Refrigeración, 4°C. V. CONCLUSIONES Sobre la base de los resultados obtenidos podemos indicar las siguientes conclusiones: 1. Se determinó que la pulpa de cocona con un índice de madurez de 6,0 presentó mejores condiciones para la obtención de zumo, caracterizándose por presentar un 92,78 por ciento de humedad; 4,2 por ciento de carbohidratos y 1, 7 4 por ciento de proteínas, y los demás componentes en pequeñas cantidades. 2. La actividad de la Poligalacturonasa ( E.C. 3.2.1.15) fue de 292 U/mi, obteniéndose un zumo más estable a la sedimentación y un rendimiento de 78,86 por ciento sobre el peso de la pulpa y 53,92 por ciento sobre el peso de la fruta entera, cuando se utilizó 0,03 por ciento de enzima a 50°C/90 minutos de hidrólisis y a pH de 3,8 natural de la fruta. 3. Se determinó que el zumo almacenado durante 60 días a refrigeración (4°C) presentó mayor estabilidad ya que las características físico-químicas no presentaron variaciones significativas, calificándose sensorialmente por su buena aceptación. VI. RECOMENDACIONES 1. Emplear el zumo de cocona como bebida refrescante, para uso en fermentaciones y otros productos. 2. Efectuar trabajos de investigación empleando otros frutos nativos de la región para fomentar su industrialización y por ende superación de la Región. 3. Utilizar un bioreactor con enzimas inmovilizadas con el fin de reducir costos de producción. VIII. BIBLIOGRAFÍA ADRIAN, J.; FRANGNE, R. 1990. La ciencia de los alimentos de la A a la Z. Zaragoza, Esp. Acribia. 317 p. ANZALDUA, M.A. 1994. La Evaluación sensorial de los alimentos en la teoría y la práctica. Zaragoza, Esp. Acribia. 198 p. A.O.A.C. 1984. Official methods of analysis of the association of official methods of analysis of the association analytical chemists. 10 ed. 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Para la Figura 6 su ecuación es: Y= HUMEDAD(%) X= GRADO DE MADUREZ Y= O, 1858 X3 - 2,0861X2 + 7,8581X + 82,744 ~ = 0,9974 Para la Figura 7 su ecuación es: Y = GRADOS BRIX X = GRADO DE MADUREZ Y= 4.740- 2.700X + 1.425X2 - 0.175 X3 ~ = 0.998 Para la Figura 8 su ecuación es: Y= PULPA /CASCARA X = GRADO DE MADUREZ Y= 0,0108X3 +O, 1089X 2 - O, 1402X ~ = 0,997 Para la Figura 9 su ecuación es: Y= pH X = GRADO DE MADUREZ Y= 5.004- 1.506X + 0.489X2 - 0.045X3 ~:::O, 996 Para la Figura 1 O su ecuación es: Y = ACIDEZ TITULABLE X = GRADO DE MADUREZ Y= 0,0025X3 - 0,0304X2 + 0,0971X + 0,852 ~ = 0.9384 94 ANEX02 Tabla 17. Análisis de varianza de los rendimientos de zumo de pulpa de cocana, empleando diferentes concentraciones de enzima (PG) F.V. S.C. Tratamiento 115.255 Error 12.000 Total 127.255 Fuente: propia g.l. 3 4 7 C.M. F F(5%) Sig. 38.418 12.806 6.591 * 3.000 Tabla 18. Prueba de rangos multiples para el rendimiento de pulpa de la cocona por % de enzima METODO DE TUKEY NIVEL COUNT . PROM. GRUPOS HOMOGENEOS 0.02 2 0.03 2 0.04 2 0.05 2 Fuente: propia CONTRASTE 0.02-0.03 0.02-0.04 0.02-0.05 0.03-0.04 0.03-0.05 0.04-0.05 Fu ente: propia 76.3 84.4 84.9 85.7 DIFERENCIAS -8.1 -8.6 -9.4 -0.5 -1.3 -0.8 X X X X + 1- LIMITES 7.05104 * 7.05104 * 7.05104 * 7.05104 7.05104 7.05104 * DENOTA DIFERENCIAS ESTADISTICAMENTE SIGNIFICATIVAS 95 ANEXO 3 Tabla 19. Resultados de la Variación de la viscosidad de la pulpa de cocona en el Tratamiento enzimático. Temperatura = so oc Concentración de Enzima = 0.03% Viscosímetro Brookfield LV. Spindle de disco No 3 Lectura del dial (*)x FACTOR= Viscosidad en Centipoise (cP) (Mitschka, 1982) (*): Promedio de dos repeticiones. Velocidad Angular (RPM) Tiempo ". (Minutos) 5· 10 20 Viscosidad (cP) o 6887 5003.0 2927.0 15 1824 1020.0 575.9 30 1680 875.8 485.9 45 1608 923.0 455.9 60 1560 805.8 446.9 75 1488 779.8 431.9 90 1440 707.8 407.9 Fuente: propia 50 1716.0 328.7 247.1 228.0 219.0 211.2 199.2 ··. 96 ANEX04 Tabla 20. Resultados para el diagrama reológico de la pulpa de cocona antes del tratamiento con PG. Temperatura = 30°C Viscosímetro Brookfield LV Spindle de disco No 3 dv/dy (1/seg) Veloc.(RPM) 0.09 0.5 0.18 1.0 0.36 2.0 -· 0.45 2.5 0.90 4.0 1.80 5.0 3.60 10.0 9.00 20.0 18.00 50.0 Fu ente: propia 't (%) J.l (cP) 12.3 29514 14.0 16796 21.7 13077 26.8 12861 34.9 10468 38.8 9310 51.1 6131 63.2 3791 87.4 2104 97 Tabla 21. Resultados para el diagrama reológico de la pulpa de cocona después del tratamiento con PG. Temperatura= 30°C Viscosímetro Brookfield LV Spindle de disco No 3 dv/dy (1/seg) Veloc. (RPM) 0.09 0.5 0.18 1.0 0.36 2.0 0.45 2.5 0.90 4.0 -.' 1.80 5.0 3.60 10.0 9.00 20.0 18.00 50.0 Fuente: propia . 't (%) J.1 (cP) 4.3 10318.0 4.7 5639.0 4.8 2879.0 5.1 2447.0 5.0 1500.0 5.7 1368.0 6.7 803.8 7.5 449.9 8.7 208.8 ANEXO 5 HOJAS DE COSTOS DE PRODUCCIÓN DETALLE MATERIAS PRIMAS Y AUXILIARES MANO DE OBRA CARGOS INDIRECTOS CANTIDAD c. u. TOTAL CANTIDAD c.u. TOTAL CANTIDAD c.u. TOTAL Coco na 100 kg 0,50 50,00 Enzima 0.002 mi 13,30 0,30 Sorbato de potasio 0,03 g 0,30 0,009 Salario 40,00 Energía Eléctrica 10,00 Envases (300 ml) 304 und. 0,2 60,80_ Tapas 304 und. 0,08 24,43 Depreciación 5 55 ' 50.31 40,00 100,78 '---~.~. -----~-- --~ --- ~----- --------- L___ -- - - -- - --- L__ - --- -- -- - CostoTotal 191,08 Unidades Producidas 304 und , Cost() Unitario_~_ _ _____ ~- -~ __ SI. O,E)2