UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL TESIS OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE BIOSORCIÓN DE PLOMO (II) CON MESOCARPIO DE TORONJA (Citrus paradisi var. Marsh) PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE INGENIERO AMBIENTAL ELABORADO POR: JIMMY MORALES ORTEGA Tingo María – Perú 2020 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA Tingo María – Perú FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS Nº 017-2020-FRNR-UNAS “OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE BIOSORCIÓN DE PLOMO (II) CON MESOCARPIO DE TORONJA (Citrus paradisi var. Marsh)” Presentado por el Bachiller: MORALES ORTEGA, Jimmy, después de haber escuchado la sustentación y las respuestas a las interrogantes formuladas por el Jurado, se declara APROBADA con el calificativo de “MUY BUENO” En consecuencia, el sustentante queda apto para optar el Título de INGENIERO AMBIENTAL, que será aprobado por el Consejo de Facultad, tramitándolo al Consejo Universitario para el otorgamiento del Título correspondiente. Tingo María, 21 de setiembre de 2020 Ing. MSc. JOSÉ ANTONIO, BLAS MATIENZO PRESIDENTE Dr. MANUEL ALFREDO ÑIQUE ALVAREZ MIEMBRO Blgo. CÉSAR AUGUSTO GOZME SULCA MIEMBRO Ing. LAURIANO ANTONIO, ZAVALETA DE LA CRUZ ASESOR Los que suscriben, Miembros del Jurado de Tesis, reunidos con fecha 15 de febrero de 2018, a horas 09:10 a.m. en la en la Sala de Conferencias de la Facultad de Recursos Naturales Renovables para calificar la Tesis titulada: DEDICATORIA A Dios. Por guiarme y darme las fuerzas necesarias para vencer los obstáculos, mostrarme el camino para poder cumplir mis metas trazadas y bendecirme cada día de mi vida. A mi madre. Delia Ortega Rojas, por su amor, comprensión, dedicación, entrega y su apoyo incondicional en mi formación académica y espiritual de valores, compartiendo buenos y malos momentos y enseñarme a encarar las adversidades con madurez. A mis hermanos Verónica, Marlon y Julián, por su cariño y confianza. Y para todos aquellos familiares y amigos que no recordé al momento de escribir esto. Ustedes saben quiénes son. “Hay tres cosas que son permanentes: la confianza en Dios, la seguridad de que él cumplirá sus promesas, y el amor. De estas tres cosas, la más importante es el amor”. 1 corintios 13:13 AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Agraria de la Selva, por haberme abierto sus puertas para estudiar y ser hoy un profesional. A mi madre que me ha brindado todo lo que soy como persona, valores, principios, perseverancia, empeño y educación. A los docentes de la Facultad de Recursos Naturales Renovables y demás facultades que me han apoyado en mi formación académica y personal, inculcándome valores, buenos hábitos y por brindarme su experiencia en conocimientos para mi formación profesional. A mis jurados de tesis: Ing. Blas Matienzo, Blgo. Ñique Alvarez, Blgo. Gozme Sulca, por sus oportunas sugerencias. A mi asesor de tesis, Ing. ZAVALETA DE LA CRUZ, Lauriano A., por el apoyo técnico incondicional, dedicación constante, confianza y esfuerzo, por sus sugerencias en la culminación y revisión del informe final. Al jefe del Laboratorio de Química, por autorizarme y permitirme realizar la ejecución de la tesis. A todas las personas que me brindaron su colaboración, conocimientos, ayuda y sobre todo su Amistad. Resumen La contaminación ambiental por metales pesados como el plomo representa un serio problema para la salud y el medio ambiente, representando un riesgo para la cadena alimenticia al ser acumulados y concentrados por organismos, así mismo estos se ven afectados por alteración de su estructura, dinámica y función. Los métodos de remoción de metales pesados son costosos y poco eficientes, por lo que conlleva a la necesidad utilizar métodos de bajo costo como la biosorción. El objetivo de la presente tesis fue optimizar el proceso de biosorción utilizando el albedo de toronja pretratada. El biosorbente se obtuvo mediante los pasos continuos de separación del mesocarpio de la cáscara de toronja, eliminación de impurezas y aceites esenciales, desmetoxilación y reticulación del mesocarpio. La optimización del proceso de biosorción se realizó mediante la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), usando el diseño de Box Behnken, validando el estudio con un ANVA. La capacidad de biosorción máxima promedio de plomo fue de 201.887 mg/g, con valores de pH 4.5, 55 ppm de Pb+2 y 0.25 g de biosorbente. La regresión múltiple de los datos dio un modelo cuadrático con un R2=93.13 %, indicando que el comportamiento de la biosorción se ajusta al modelo y es confiable para hacer predicciones. Así mismo, el ANVA para la biosorción demostró que las variables independientes y la interacción de dos de estas son estadísticamente significativas (p<0.05). Por otro lado, la optimización de la biosorción se logró al experimentar valores de peso de biosorbente, concentración de Pb+2 y pH a 0.0501778 g, 379.92 ppm y 3.0, respectivamente, cuyo valor alcanzado fue de 243.145 mg/g, excediendo en +1.2 del valor óptimo estimado, esto valida y demuestra que el modelo representa correctamente los datos observados. El albedo de toronja tiene buena capacidad para la biosorción de plomo (II) y se puede maximizar esta capacidad mediante el ajuste de los datos a un modelo que los represente. Se recomienda utilizar otros métodos de pretratamiento y MSR para maximizar la biosorción de Pb+2. ÍNDICE Página I. INTRODUCCION ....................................................................................... 1 II. REVISIÓN DE LITERATURA .................................................................... 4 2.1. Metales pesados ............................................................................ 4 2.2. Metales pesados en el ambiente .................................................... 4 2.2.1. El plomo ................................................................................ 4 2.3. Adsorción ....................................................................................... 5 2.4. Biosorción ....................................................................................... 5 2.4.1. Ventajas y desventajas de la biosorción ............................... 6 2.4.2. Mecanismo de biosorción ..................................................... 7 2.4.3. Biosorbentes ......................................................................... 8 2.5. Factores que afectan la biosorción ................................................. 8 2.5.1. En función de la propiedad del material biosorbente ............ 9 2.5.2. En función de la propiedad de la disolución ........................ 10 2.5.3. En función de las condiciones de operación ....................... 11 2.6. Biosorción por pectina .................................................................. 12 2.6.1. Pectina como biosorbente ................................................... 12 2.6.2. Estructura química de las pectinas ..................................... 14 2.6.3. Mecanismo de biosorción de plomo (II) por pectina ............ 14 2.7. Citricultura en Perú ....................................................................... 15 2.7.1. La toronja ............................................................................ 16 2.7.2. Panorama de la toronja ....................................................... 17 2.8. Diseño de experimentos ............................................................... 18 2.8.1. Metodología de superficie de respuesta ............................. 18 2.8.2. Diseño para estimar superficies de respuesta de segundo orden 19 2.8.3. Diseño de Box-Behnken ..................................................... 19 III. MATERIALES Y METODOS ................................................................... 21 3.1. Lugar de ejecución ....................................................................... 21 3.1.1. Condiciones del lugar de ejecución .................................... 21 3.2. Materiales y equipos ..................................................................... 21 3.2.1 Materiales ............................................................................ 21 3.2.2 Material biológico ................................................................. 22 3.2.3 Reactivos ............................................................................. 22 3.2.4 Equipos ................................................................................ 22 3.2.5 Logística para análisis.......................................................... 22 3.3. Tratamientos y variables en estudio ............................................. 23 3.3.1. Tratamientos ....................................................................... 23 3.3.2. Variables ............................................................................. 23 3.4. Metodología .................................................................................. 23 3.4.1. Determinación de la capacidad de biosorción ..................... 23 3.4.2. Obtención del modelo matemático ...................................... 28 3.4.3. Maximización de la biosorción ............................................ 29 IV. RESULTADOS ........................................................................................ 30 4.1. Determinación de la capacidad de biosorción de Pb+2 ................. 30 4.2. Modelo matemático del proceso de biosorción de Pb+2 ............... 31 4.3. Maximización de la biosorción ...................................................... 36 V. DISCUSIÓN ............................................................................................. 37 VI. CONCLUSIONES .................................................................................... 41 VII. RECOMENDACIONES ........................................................................... 42 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 43 ANEXO ............................................................................................................ 54 INDICE DE CUADROS Cuadro Página 1. Ventajas y desventajas de la biosorción. ....................................................... 6 2. Contenido de sustancias pécticas en vegetales conocido (g/100 g materia fresca) .............................................................................................................. 13 3. Niveles de tratamientos y valores codificados de factores. .......................... 24 4. Combinaciones de los tratamientos evaluados. ........................................... 24 5. Concentraciones de equilibrio y capacidad de biosorción. ........................... 30 6. Efecto, desviación estándar y coeficientes de los factores e interacciones. 31 7. Análisis de varianza de los factores e interacciones del modelo.................. 32 8. Valor óptimo para maximizar la biosorción................................................... 36 9. Verificación del valor óptimo. ....................................................................... 36 10. Datos consolidados de porcentaje de remoción y biosorción de plomo por mesocarpio de toronja. INDICE DE FIGURAS Figura Página 1. Mecanismo de bioadsorción de metales pesados. ......................................... 7 2. Estructura de la pectina. .............................................................................. 14 3. Modelo de intercambio iónico entre el Ca (II) ligado a las cadenas poligalacturónicas y el Pb (II) en solución. ....................................................... 15 4. Partes del fruto de un cítrico. ....................................................................... 17 5. Estructura del Diseño de Box-Behnken. ...................................................... 20 6. Diagrama de pretratamiento del mesocarpio de toronja y desmetoxilación. 26 7. Diagrama de reticulación del mesocarpio de toronja. .................................. 27 8. Comportamiento de las variables independientes en el proceso. ................ 31 ..................................................................................... 65 9. Probabilidad normal de los efectos estandarizados. .................................... 33 10. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados con p=0.05. ............... 34 11. Probabilidad Normal de los residuos. ......................................................... 34 12. Diagrama tridimensional de superficie para la biosorción de Pb (II) usando mesocarpio de toronja. ..................................................................................... 35 13. Extracción de albedo de toronja. ................................................................ 54 14. Adición de Etanol de 63° para eliminación de impurezas. ......................... 54 15. Lavado del albedo con alcohol de 96°. ...................................................... 55 16. Lavado del albedo con NaOH 0,2 M a 4 °C. .............................................. 55 17. Biosorbente listo para ser utilizado. ........................................................... 56 18. Pesado de Nitrato de plomo para solución de 400 ppm. ............................ 56 19. Soluciones de plomo (II) a 49,52; 219,80 y 381,80 ppm. ........................... 57 20. Frasco conteniendo 50 mL de solución de Pb (II). ..................................... 57 21. Pesado del biosorbente para ser usado en el proceso de biosorción. ....... 58 22. Regulación de pH a los valores establecidos. ............................................ 58 23. Corrida de los tratamientos con sus respectivas repeticiones. ................... 59 24. Vista de biosorbente y solución problema después del proceso. ............... 59 25. Filtrado de las muestras después del proceso. .......................................... 60 26. Biosorbente conteniendo Pb(II) en filtro. .................................................... 60 27. Refrigeración de las muestras a 8 °C. ........................................................ 61 28. Dilución de las muestras en 1/10 y 1/100 .................................................. 61 29. Espectrofotómetro de absorción atómica utilizado para la lectura de las muestras. ......................................................................................................... 62 30. Resultados de análisis de plomo en muestras tratadas. ............................ 66 31. Resultados del análisis de plomo en el mesocarpio de toronja y el método utilizado para su análisis. ................................................................................. 67 32. Matriz del Diseño de Box-Behnken para tres factores. .............................. 69 I. INTRODUCCION La contaminación ambiental como también el desgaste de diversos ecosistemas se han intensificado por el creciente o aumento de la actividad industrial, ocasionando una acumulación de metales pesados y compuestos sintéticos diversos (ALE et al., 2015). La producción residual de las actividades mineras y metalúrgicas se considera la principal fuente de contaminación por metales pesados. Algunos de los metales asociados con estas actividades son cadmio (Cd), cromo (Cr), plomo (Pb) y mercurio (Hg) (BAILEY et al., 1999), por lo que los métodos de eliminación rentables son necesario. Los metales han llevado al desarrollo de nuevas tecnologías para separar los metales de los cuerpos de agua naturales (VOLESKY, 1995). Sabemos que un metal altamente tóxico es el plomo porque es causante de daños neurológicos en los organismos. Tales organismos poseen la habilidad de acumular y concentrar a este metal, incrementando el riesgo de toxicidad sobre la cadena alimenticia; perturbando su estructura, dinámica y función (NAVA y MÉNDEZ, 2011). La remoción del Pb (II) se puede realizar con diversos métodos. Utilizando materiales que contienen resina, los métodos más comunes para eliminar metales pesados (incluido el plomo) que sus desventajas son económicas (intercambio de iones convencional, extracción líquida o electrolítica, electrodiálisis) o técnicamente complejos (precipitación, cementación, ósmosis inversa). Utilizan materiales de Intercambiador, filtro de membrana, hidróxido de naftaleno, carbón activado, resina quelante y capa de polímero poroso, etc. (MINAMISAWA et al., 2004). Además, SAMAL et al. (2016), afirmó que estos producirán contaminantes secundarios. 2 Esta situación genera que la utilización de estos materiales de origen biológico se considere de alternativa debido a que se puede mover y/o la recuperacion de metales, que se apoya en las propiedades de secuestro metálico de ciertos materiales naturales, y se conoce comúnmente como biosorción (VOLESKY, 1994). Después de los procesos económicos convencionales, la biosorción de iones metálicos se considera que tienen las tecnologías más prometedoras involucradas en la desaparicion de estos iones tóxicos, quienes continúan procesos a bajos costos. Tales procesos son originarios de materiales de desechos biológicos (bacterias, algas, hongos, alginatos y residuos agrícolas) así como de la disminución en el volumen de producto químico y lodos biológicos. Los desechos biológicos presentan biopolímeros estructurales, y estos son responsables de interactuar con metales pesados, los cuales son al quitosano, alginato, carragenanos, pectinas, y otros. En este grupo amplio de materiales biológicos sobresale la aplicación de las cáscaras de cítricos como la toronja (VILLANUEVA, 2006 y MUÑOZ, 2007). El mesocarpio de los cítricos contiene pectina, sustancia que al ser tratada puede ser aplicada como adsorbente natural de bajo costo, y presenta una propensión a adsorber metales pesados como lo son el Hg, Cd y Pb, los cuales el plomo presenta mayor afinidad a la biosorción por quelación (Aydin citado por GARCIA et al., 2011). Por tal motivo, es necesario tener una línea base de las variables fisicoquímicas en la biosorción de plomo (II) con mesocarpio de toronja (Citrus paradisi var. Marsh) al analizar peso del biosorbente, concentración de Pb+2 y pH de la solución, con la finalidad de conocer las condiciones óptimas de adecuación del medio o solución. Problema: Frente al efecto negativo del plomo en el medio ambiente y la existencia de la necesidad de remover este metal, se planteó la interrogante 3 ¿Bajo qué valores de peso de biosorbente, concentración de Pb+2 y pH de la Solución y en qué cantidad se optimiza la biosorción de plomo (II) aplicando mesocarpio de toronja (Citrus paradisi var Marsh)? Hipótesis: Si el proceso de biosorción se adecúa a las condiciones dentro del rango estudiado donde el peso del biosorbente es el más alto, la concentración de Pb+2 el más bajo y pH>4, entonces se optimizará la biosorción, obteniendo una biosorción promedio de 100 mg Pb/g de biosorbente. 1.1. Objetivo general: Optimizar el proceso de biosorción de plomo (II) con mesocarpio de toronja. 1.2. Objetivos específicos:  Determinar la capacidad de biosorción de plomo (II) con mesocarpio de toronja.  Determinar el modelo matemático del proceso de biosorción de plomo (II) con mesocarpio de toronja  Maximizar la biosorción de plomo (II) con mesocarpio de toronja. 4 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Metales pesados Se considera un grupo de elementos químicos propias de la naturaleza, cuyo peso molecular es alto (60 - 220 g/mol), así mismo, también se le denomina metales pesados porque tienen altas densidades (4 - 7 g/cm3), estos a la vez pueden formar especies químicas no degradables y por lo general son tóxicos para los seres humanos (ERÓSTEGUI, 2009). 2.2. Metales pesados en el ambiente Los podemos encontrar de manera natural en la corteza terrestre. Consideramos que estos en un momento pueden llegar a convertirce en contaminantes si su distribución o esparcimiento en el ambiente se altera mediante diversas actividades humanas. 2.2.1. El plomo Es considerado que el plomo es un metal pesado (densidad relativa, o gravedad específica, de 11.4 s 16ºC (61ºF)), de color azuloso, que se empaña para adquirir un color gris mate. Es moldeable, inelástico, se funde con facilidad a 327.4 ºC (621.3 ºF) y hierve a 1725 ºC (3164 ºF). Las valencias químicas normales son 2 y 4. Es relativamente resistente al ataque de los ácidos sulfúrico y clorhídrico. Pero se disuelve con lentitud en ácido nítrico. Además, se considera que puede ser anfótero, porque forma sales de plomo de los ácidos, y sales metálicas del ácido plúmbico. Este también forma diversas sales, óxidos y compuestos organometálicos. 5 Este metal no es fundamental o esencial para los seres vivos, sin embargo, se encuentra en los tejidos y órganos de los mamíferos; entra en la cadena cuando estos forman compuestos o especies químicas que se encuentra adheridos a compuestos orgánicos (VILLANUEVA y BOTELLO, 1992). 2.3. Adsorción Es un mecanismo que nos ayuda a dividir uno o más componentes de una fase fluida en la superficie de una fase sólida y es llamado adsorbato. La adsorción es en el interior del adsorbato sobre las paredes de los poros en areas específicos. La separación inicia por las distinciones de peso molecular o de polaridad que dan cabida a que específicas moléculas se adhieren más fuertemente a la superficie que otras (McCABE et al., 1991). Los tres mecanismos diferentes de la adsorción se basan en: estérico por permitir el paso de moléculas pequeñas a través del poro del adsorbente, equilibrio por la afinidad del adsorbente a las especies químicas de iones y cinético por las velocidades en la difusión de compuestos en los poros (MESTANZA, 2012). 2.4. Biosorción La palabra "biosorción" es indicativo para el consumo de iones metálicos por biomasa viva o muerta mediante a mecanismos fisicoquímicos como lo son la adsorción o el intercambio iónico. Una vez se aplica la biomasa viva, también se considera que estos mecanismos de asimilación metabólica pueden promover el proceso de biosorción (CAÑIZARES, 2000). KOTRBA et al., (2011) y REZAEI (2016), señalan que la biosorción es un método que emplea materiales de origen biológico, principalmente provenientes de biomasa inerte y cuyos mecanismos responsables de remoción, pueden darse a partir de uno o una combinación de procesos como intercambio 6 iónico, complejación, coordinación, adsorción, interacción electrostática, quelación y micro precipitación. La biosorción como proceso fisicoquímico incorpora los fenómenos de adsorción como también absorción de las moléculas e iones. La tecnología de biosorción tiene siimilitud a la del carbón activado (Fruz, 1981 citado por MUÑOZ, 2007) e intercambio iónico (SIMON, 1991). Esta tecnología se dirige prioritarianmente a la remoción de metales pesados o especies metaloides de soluciones diluidas por diversos materiales de origen biológico (algas, hongos, bacterias, frutos, productos agrícolas y algunos tipos de polímeros) (SIMON, 1991; KIRCHMER, 1986), estos materiales los encontramos en grandes cantidades dentro de la naturaleza y su tranformacion a biosorbentes es económico su proceso. 2.4.1. Ventajas y desventajas de la biosorción Las ventajas y desventajas fundamentales de la biosorciónreferentes a diferentes tratamientos con los que se enfrenta esta tecnología a constinuacion los mencionamos: Cuadro 1. Ventajas y desventajas de la biosorción. Ventajas Desventajas  Tecnología de bajo coste, por el reducido coste de los biosorbentes, escaza necesidad de reactivos y bajo consumo energético del proceso.  Presenta una elevada eficacia, especialmente cuando la concentración de metal en el agua residual es baja.  Es posible la regeneración de un gran número de biosorbentes, pudiéndose utilizar en ciclos sucesivos de adsorción-desorción.  Las técnicas convencionales están ampliamente extendidas y son muy conocidas en diversos sectores industriales, lo que dificulta enormemente su sustitución.  Las interacciones de diferentes especies químicas de iones con los biosorbentes pueden ocasionar cambios en la capacidad de retención, disminuyendo la eficacia del proceso. Se debe caracterizar las 7  Permite la recuperación del metal tras el proceso de regeneración.  Frente a la precipitación, la biosorción no genera fangos químicos, y el único residuo del proceso es el biosorbente agotado tras sucesivos ciclos de biosorción/regeneración.  Permite la valorización de residuos que se utilizan como biosorbentes.  Reduce el impacto ambiental por el uso de materiales residuales de diversa procedencia sin tratamiento previo, y en especial sin carbonización previa, frente al de los adsorbentes tradicionales como los carbones activados. aguas residuales a tratar para evitar interacciones indeseables, y programar adecuadamente los ciclos de operación, para conseguir el máximo aprovechamiento del sistema manteniendo las condiciones de calidad requeridas al efluente.  La selección de los materiales biosorbentes debe realizarse atendiendo a la disponibilidad de los mismos en cantidad y reducido coste para conseguir una aplicación extendida de la biosorción a nivel industrial. Fuente: IZQUIERDO, 2010. 2.4.2. Mecanismo de biosorción La biosorción sucede en el momento que los cationes de los metales se unifican por interacciones electrostáticas a los sitios aniónicos (HANG y SMIDSROD, 1970), que estan en la pared celular del material biosorbente. Lugares que estan como centros activos para la biosorción los ubicamos en los grupos carboxilo (FOUREST y SERRE, 1996), hidroxilo, amino, sulfónico, son parte de la estructura molecular de la mayoría de los polímeros de origen biológico (ALE et al., 2015). Fuente: MUÑOZ, 2007. Figura 1. Mecanismo de bioadsorción de metales pesados. 8 2.4.2.1. Adsorción física Se da cuando las fuerzas son debido a las fuerzas de Van del Waals como las interacciones tipo dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido o fuerzas de dispersión, se usa el término de adsorción física o fisiosorción, en este tipo de adsorción, la molécula adsorbida no está fija en un lugar específico de la superficie, sino está libre de trasladarse en la interface (GARCÉS y COAVAS, 2012). 2.4.2.2. Intercambio iónico En su mayor parte los sorbentes están contenidos por sales de Na+, K+, Ca+2 y Mg+2 en las estructuras de su pared celular; esto quiere decir que los cationes pueden ser intercambiados con los iones metálicos pesados y quedar unidos al material. Estudios específicos previos dicen que el intercambio iónico es el principal mecanismo en la sorción de Cd+2 y Zn+2 con restos de yuca, pero se considera que el mecanismo de sorción está presente en gran parte de los sorbentes de origen vegetal (BOADA, 2015). 2.4.3. Biosorbentes Los biosorbentes son materiales procedentes de microorganismos, bacterias, hongos, algas, plantas o ciertos polímeros naturales. Los biosorbentes para aplicaciones, es de obligación ser sometidos a un pretratamiento químico y asi obtener una mayor y mejor capacidad de adsorción en el proceso de remoción de metales pesados o en la recuperación de las especies metálicas en solución. (BRIERLEY, 1987). 2.5. Factores que afectan la biosorción Existe poco conocimiento sobre el proceso de adsorción en fase liquido-solido, debido a la existencia de interacciones entre adsorbato- 9 adsorbente (ideal), adsorbato-adsorbato y adsorbente-disolvente, esta interacción determina la afinidad del adsorbente por adsorbato en un disolvente y es preciso que la afinidad del adsorbato por el disolvente sea nula, para que la adsorción se vea favorecida (MESTANZA, 2012). La biosorción en general se ve afectada por una serie de propiedades y características del biosorbente, la solución y condiciones de operación. 2.5.1. En función de la propiedad del material biosorbente 2.5.1.1. Tipo de material biosorbente La retención de metales es función de la composición y reactividad química de la superficie biosorbente. Cuando se utilizan biosorbentes en sistemas continuos o de grupo, se deben considerar la naturaleza y densidad de las partículas, la porosidad, la resistencia mecánica, el tamaño y la forma. Con respecto a las propiedades químicas del biosorbente, se cree que cuanto mayores son los grupos funcionales aparentes (carboxilo, fenol, fosfato, sulfato, amino, amida e hidroxilo) en la superficie, mayor es la biosorción de metales pesados. Generalmente, si el biosorbente es superior a 100 mg / g de biosorbente o 1 mmol / g, se dice que tiene una buena capacidad de biosorción. (BOADA, 2015). 2.5.1.2. pH en el punto de carga cero (pHZPC) pHZPC es el valor de pH cuando la densidad de carga superficial del biosorbente es cero. Con pHZPC se puede caracterizar el comportamiento ácido-base de los biosorbentes. Cuando el pH de la solución es menor que pHZPC, la carga total en la superficie del biosorbente es positiva, lo que evita la interacción con sustancias cargadas positivamente en la solución. Cuando la solución tiene un pH> pHZPC, la carga total en la superficie del biosorbente es 10 negativa y el biosorbente tendrá una mayor capacidad para adsorber cationes. (BOADA, 2015). 2.5.1.3. Tamaño de partícula Mientras menor sea el tamaño de partícula de biosorbente mayor será la capacidad de biosorción y velocidad de reacción en sistemas de discontinuos. La consideración del tamaño de partícula varía en función del sistema de operación en uso, siendo la presión el factor determinante de la eficiencia de remoción (BOADA, 2015). 2.5.1.4. Superficie especifica Esta propiedad es aplicada sobre el material granular o particulado y se la consigue de la relación del área superficial total y la masa del sólido o su volumen; para los materiales bioabsorbentes, es fundamentalmente importante esta característica porque cuanto mayor es la superficie específica, más probable es que la adsorción entre en contacto con una gran cantidad de centros activos disponibles y alcance la adsorción (BOADA, 2015). 2.5.2. En función de la propiedad de la disolución 2.5.2.1. Influencia del pH El conocimiento del pH óptimo de la solución para la biosorción es primordialmente función del tipo de adsorbato, de la naturaleza química del biosorbente y de la composición del adsorbato a eliminar. El factor más importante es el valor del pH de la fase acuosa, en la biosorción de cationes y aniones los efectos en los dos casos son diferentes. Por lo tanto, durante la absorción de cationes, generalmente se prefiere que el pH sea mayor de 4,5, ya que se reduce la protonación, reduciendo así la competencia de los iones H+ con los iones metálicos Mn+; mientras que la 11 adsorción de aniones prefiere un valor bajo de pH, entre 1,5 y 4 (BOADA, 2015 y TENORIO, 2006). SCHIEWER (1996), menciona que hay tres vías de influencia del pH en la biosorción del metal: 1. El cambio de estado químico del sitio activo varia con el valor del pH, haciendo sensible al grupo de unión del metal y quedando condicionado la disponibilidad de ocupación del sitio libre. 2. Valores extremos de pH dañan la estructura del sorbente, afectando la distorsión de células, pérdida de peso y descenso en la capacidad de adsorción. 3. La especiación del metal depende del pH, porque los metales en solución están ubicados como iones hidrolizados a pH bajos. 2.5.2.2. Presencia de otros iones La evidencia de la presencia de otros iones en la solución le permite competir con el metal de interés por los sitios de unión, reduciendo así la retención. Generalmente, en la biosorción catiónica, la fuerza de unión de los iones de metales ligeros no es tan fuerte como la de los iones de metales pesados. (SCHIEWER, 1996). 2.5.3. En función de las condiciones de operación Las condiciones de operación del proceso de biosorción tienen una influencia en la efectividad del mismo. 2.5.3.1. Tiempo de contacto El tiempo de contacto adecuado del biosorbente y el sorbato, se determina por el estudio de cinética de la biosorción, no obstante, el tiempo de contacto no es estándar, sino que dependerá del tipo material e ion a remover (BOADA, 2015). 12 2.5.3.2. Temperatura Se reconoce que la temperatura tiene una mayor influencia en el proceso de absorción (KUYUCAK y VOLESKY, 1989). El efecto de la temperatura sobre la biosorción depende del calor de adsorción (cambio de entalpía). Generalmente, cuando la adsorción es física, el calor de adsorción es negativo, lo que significa o indica que el nivel de reacción es exotérmico y útil a bajas temperaturas. (GLASSTONE et al., 1941). La biomasa incluye más de un sitio activo para la vinculacion del metal. Los resultados de temperatura para cada ubicación son diferentes y pueden tener diferentes efectos en la unión de metales, pero el calor de reacción de la mayoría de los metales es frecuente y no tiene relación con el grado de ocupación del sitio activo adsorbente. (WEPPEN y HORNBURG, 1995). 2.6. Biosorción por pectina 2.6.1. Pectina como biosorbente Ampliamente las pectinas de las frutas cambian en sus propiedades gelificantes por las distintas longitudes de sus cadenas de ácido poligalacturonico y al desigual grado de esterificación de su grupo carboxilo (SOTO, 2009). La muestra de mesocarpio se considera dependiente a distintos factores ajenos a nuestro propósito, conextadas con la cosecha del mismo, JONA et al., (1989) desarrollaron un estudio donde detallan la mutacion o cambio de componentes que se encuentran presentes en el mesocarpio como lo son la pectina, celulosa, hemicelulosa y polisacáridos en temporadas del año en las cuales son cosechadas, y reportaron que existen temporadas donde hay un menor numero de pectina y hemicelulosa. 13 La capacidad de sustancias pécticas cambia con la fuente, variedad, grado de madurez, condiciones climáticas e incluso según las distintas partes de la misma planta (BRAVERMAN, 1977). Cuadro 2. Cantidad de sustancias pécticas evidenciadas en los vegetales conocido (g/100 g materia fresca) La importancia de la pectina como biomasa adsorbente se debe a su estructura celular que consta de grupos carboxilo e hidroxilo, los cuales son afines a los metales pesados, esto conlleva a que sus cationes se unan mediante interacciones electrostáticas a los aniones del bioadsorbente (VILLANUEVA y TAPIA, 2005). AREVALO et al. (2003), menciona que la pectina tiene la capacidad de retener metales pesados por medio de un mecanismo de acomplejamiento, siendo esto posible debido a que se encuentra como polielectrolito cargado negativamente y es capaz de unirse a iones (+). Así mismo, se destaca la afinidad de la pectina por los siguientes metales: Plomo (Pb) > Bario (Ba) > Cadmio (Cd) > Estroncio (Sr). 14 Según al grado de metoxilación existen dos tipos de pectina, una con alto metoxilo (HM) y el otro con bajo metoxilo convencional (LMC). Las pectinas producidas con procesos convencionales son HM y presentan elevado número de grupos carboxílicos esterificados con alcohol metílico, y de manera contraria, cuando ocurren variaciones en el proceso o se da tratamiento acido prolongado, se obtiene pectina LMC con bajo grupos carboxílicos (SILVATEAM, 2015). 2.6.2. Estructura química de las pectinas La estructura de la pectina es fundamental para definir la fuerza y flexibilidad de las paredes celulares de las plantas. En su composición, la pectina se puede definir como un polímero integrado prioritariamente por cadenas de unidades de acido poli-α-D-galacturónico unidas por enlaces glicosídicos. Las sustancias pécticas son polímeros lineales de ácido galacturónico, y constituyen a una gran cantidad en su estructura de grupos carboxilo esterificados por radicales metilo (HIRST, 1988). Fuente: MUÑOZ, 2007. Figura 2. Estructura de la pectina. 2.6.3. Mecanismo de biosorción de plomo (II) por pectina La remoción de metales por pectina reticulada con Ca +2 ocurre primordialmente debido a un fenómeno de cambio iónico (propio de los iones metálicos divalentes) con el Ca +2 y los iones metálicos en solución hasta conseguir el equilibrio. Es asi que forma el Ca +2 estrelazdo a las cadenas poligalacturonicas (MORAWETZ, 1975), es desplazado por el Pb +2 hasta lograr que las fases de consetraciones se equilibren. Los grupos intercambiadores 15 iónicos son los grupos carboxilo, la ecuación (1) describe este proceso de Intercambio Iónico Metal/Calcio. R2Ca+2 + M+2 ----> R2M+2 + Ca+2 (1) Fuente: MUÑOZ, 2007. Figura 3. Modelo de intercambio iónico entre el Ca (II) ligado a las cadenas poligalacturónicas y el Pb (II) en solución. El mecanismo cinético es muy complejo porque puede comprometer reacciones o interacciones entre grupos funcionales del biosorbente y del soluto. Como tambien, se debe considerar los procesos de transferencia de materia, tales como transporte de especies en el seno de la fase líquida hasta la superficie del sólido (PINZÓN y VERA, 2009 y SICCHA, 2012). 2.7. Citricultura en Perú La producción y el consumo de cítricos en todo el mundo han aumentado. Los datos estadísticos de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAOSTAT) revelan que la producción mundial de cítricos en 2013 fue de 136,3 millones d toneladas, y según CASTILLO (2016), Perú ocupa el puesto N° 11 en el ranking mundial al 2013. En Perú se tiene una producción de 19551,68 miles de toneladas métricas (INEI, 2014). Por lo que conlleva a que una gran cantidad de residuos de cítricos se genere por el consumo de estos frutos, que puede ser tan alto como el 50 % del peso del fruto. Hasta el momento, la mayor parte de los residuos de cítricos se 16 depositan o disminullen por combustión o se usan como materia prima para la extracción de sustancias activas y la fabricación de piensos, lo que provoca graves contaminaciones ambientales y gran desperdicio de recursos. Es decir, es altamente deseable desarrollar maneras verdes y económicas para tratar los desechos cítricos, así como utilizarlos para producir productos básicos o de valor agregado tales como adsorbentes (BHATNAGAR et al., 2015). 2.7.1. La toronja La toronja es probablemente de origen de las Antillas, fue explicada y trazada en 1750 por primera vez; su origen está ligado a la mutación del pomelo o toronja de la india. Es un árbol grande, y su fruto es redondo, mas frande que la naranja, con cáscara amarilla; la pulpa es dividida en 12-14 gajos, de color amarillento o rosado. Sus semillas son blancas y medianas. Así mismo, existe una gran variedad de toronjas, que pueden estar divididas por el color de pulpa (amarillo y rosada), con semillas (Duncan, Indian river, Walters, Imperial, Triumph y Jordan), sin semillas (Marsh y Davis) y otras variedades comerciales que son derivadas de las anteriores (GEILFUS, 1994). 2.7.1.1. Partes del fruto El fruto de la toronja presenta las siguientes partes: El pericarpio que es la parte exterior del fruto y se fracciona en tres partes. El exocarpo o flavedo, es la parte más externa del fruto, que está formado por una epidermis, cubierta por una cutícula y varias capas de células, formando un parénquima compacto. El endocarpo, que es la parte más interna del pericarpio. Entre ambos se encuntra el mesocarpo o albedo, conformado por un tejido parenquimatico de diferentes filas de células, con grandes espacios intercelulares y de aspecto esponjoso. Cada una de estas partes varia en algunas características físicas y químicas de acuerdo a la variedad (AGUSTI, 2003). 17 Fuente: www.tecnicoagricola.es Figura 4. Partes del fruto de un cítrico. 2.7.2. Panorama de la toronja Según FAOSTAT al 2013, la producción de toronja representa el 6 % (8,2 MT) a nivel mundial, de las cuales Perú produce el 0,121 %. Según la Dirección Regional de Agricultura de Junín, a nivel nacional la región que lidera la producción de toronja es Junín, en el 2012 tuvo una producción de 542 t y Huánuco ocupando el quinto lugar con 196 t. La toronja se cultiva en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con una producción promedio de 4 millones y 4760 toneladas métricas anuales, en el mundo y Perú respectivamente (INEI, 2014). Y se caracteriza por tener doble membrana de cáscara que la mayoría de los cítricos. Por lo tanto, se genera una gran cantidad de residuo de cáscara de toronja. Cuya estructura contiene polímeros insolubles en agua, como son la pectina, celulosa, hemicelulosa y lignina, representando entre 50 % y 70 % de dicha fracción insoluble. La importancia de estos polímeros resalta en el alto contenido de grupos funcionales carboxilo e hidroxilo, que pueden unirse a contaminantes en solución acuosa (BHATNAGAR et al., 2015). 18 2.8. Diseño de experimentos El diseño de experimentos (DOE) es una herramienta estadística para el perfeccionamiento de la calidad, generalmente utilizada en proyectos Six Sigma. Esta metodología se utiliza para diseñar las condiciones ideales para productos, procesos o servicios de modo que se utilice el número mínimo de experimentos para cumplir con los estándares requeridos. DOE es muy útil para analizar procesos complejos con una gran cantidad de variables y es necesario ajustar esas variables para optimizar la respuesta. Para lograr el objetivo, es necesario seguir el proceso de planificación, diseño y análisis de experimentos, para obtener conclusiones efectivas y objetivas de manera eficiente e integrar métodos estadísticos simples y complejos con métodos de diseño experimental (ANTONY, 2014).DOE es muy útil para analizar procesos complicados con una gran cantidad de variables que se desea ajustar para optimizar la respuesta. Y para alcanzar los objetivos hay que seguir un proceso de planificación, diseño y análisis del experimento, para poder obtener conclusiones válidas y objetivas de manera eficaz, integrando métodos estadísticos simples y complejos en la metodología del diseño experimental (ANTONY, 2014). 2.8.1. Metodología de superficie de respuesta El método de respuesta de superficie (MSR) fue propuesto por Box y Wilson en 1951. Es un conjunto de técnicas que permite a los investigadores examinar los efectos de los cambios en los experimentos que pueden mostrarse como respuestas de superficie. El factor cuantitativo en el valor utilizado para la variable dependiente o respuesta. Es decir, se trata de descubrir los valores óptimos maximos de las variables independientes que aumentan, minimizan o cumplen ciertas restricciones en la variable respuesta (FIGUEROA, 2003). Uno de los ciclos del analisis de una superficie de respuesta involucra la selección del diseño experimental, en estos son bien conocidos los que conceden la estimacion de ciertos parámetros en modelos de primer y 19 segundo orden. En el primer tipo evidenciamos el diseño factorial 2k, replicaciones factoriales del diseño 2k, el diseño simplex, el diseño de Plackett- Burman entre otros. Del segundo tipo es frecuentes el diseño factorial 3k, el diseño de Box-Behnken, el diseño central compuesto, el diseño equiradial, el diseño rotable cilíndricamente y el rotable asimétrico, el diseño saturado de Box- Draper y muchos otros (DARGHAN et al., 2011). 2.8.2. Diseño para estimar superficies de respuesta de segundo orden Los diseños de segundo orden son diseños que pueden estudiar los efectos de interacción y los efectos cuadrados además de los efectos lineales. Y estos se pueden usar cuando es fundamental desarrollar o extender superficies más complicadas y complejas, o cuando se determina el área de mejor respuesta y se quiere determinar la superficie de respuesta. La elección de estos diseños específicos necesita de las particularidades del dilema o problematica, pero en general están ligados al cumplimiento de ciertos requerimientos como la capacidad para ejecutar estimaciones eficacez de los coeficientes del modelo y determinar el error experimental y la probable presencia de falta de ajuste (SIQUEIROS, 2004). 2.8.3. Diseño de Box-Behnken Los diseños de Box-Behnken (DBB) son factoriales incompletos a tres niveles en los que los puntos experimentales son escogidos especificamente para aceptar una estimación eficiente de los coeficientes de un modelo de segundo orden (BOX et al., 2008). Una opcion de diseño para adaptar los modelos cuadráticos que necesiten los tres niveles de cada factor. Es un diseño cuadrático independiente que se conforma juntando factoriales 2k con diseños de bloques incompletos balanceados (SIQUEIROS, 2004). El DBB se construye con: 20 Puntos centrales que son favorecedores para experimentar y examinar la evidencia de la curvatura, facilitar información referente a los efectos cuadráticos y brindar una estimación de la magnitud del error experimental. Puntos referentes a la superficie, de la misma distancia del punto central. Este diseño ayuda a localizar los puntos medios de las aristas y el punto central del espacio procesado, como se plasma en la figura numero 5, para el caso de tres factores. Es un diseño rotable o casi rotable. Fuente: GUTIÉRREZ y DE LA VARA, 2008 Figura 5. Estructura del Diseño de Box-Behnken. 21 III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Lugar de ejecución Esta investigación se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Química de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS), ubicado en la localidad de Tingo María, distrito de Rupa-Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de Huánuco. 3.1.1. Condiciones del lugar de ejecución La UNAS geográficamente se encuentra inscrita en la jurisdicción territorial de la ciudad de Tingo María, razón por la cual las condiciones climáticas son similares, presentando una precipitación acumulada anual media de 3400 mm y una temperatura promedio máxima y mínima de 30 °C y 18 °C respectivamente. 3.2. Materiales y equipos 3.2.1. Materiales  Fiolas de 1000, 500 y 250 mL  Vasos de precipitado de 250, 500 y 1000 mL  Matraces de Erlenmeyer de 250 mL  Pipetas volumétricas de 1 y 5 mL  Probeta de 50 mL  Frascos de vidrio de 130 mL  Embudos de vidrio de vástago largo  Espátula de acero inoxidable 22  Piscetas  Papel filtro Whatman N° 40 y N° 1  Soporte de madera para embudos  Tamiz 160  Bolsas plásticas 3.2.2. Material biológico  Mesocarpio de Toronja (Citrus paradisi var. Marsh) pretratada 3.2.3. Reactivos  Solución de NaOH 0.1 M  Solución de HCl 0.05 M  Solución de HCl 0.1 M  Solución de CaCl2 0.2 M  Solución de PbNO3 0.02 N  Solución de Plomo (II) a 100,250, y 400 ppm  Agua desionizada  Solución de Ácido Nítrico 1:1 3.2.4. Equipos  Espectrofotómetro de Absorción atómica SpectrAA 55B-VARIAN  pH metro Mettler Toledo MP220  Agitador magnético  Máquina de moler  Balanza analítica  Refrigeradora Coldex  Secadora con viento 3.2.5. Logística para análisis  Laptop  Software Statgraphics Centurion XVI.I 23 3.3. Tratamientos y variables en estudio 3.3.1. Tratamientos En el estudio se evaluó 15 tratamientos, cuyas combinaciones fueron tal como se muestra en el Cuadro 4. 3.3.2. Variables Las variables que se utilizaron para la experimentación, fueron los siguientes: Variable dependiente: Biosorción de plomo (II) expresado en mg/g. Variables independientes: Concentración de plomo (II), pH y peso del mesocarpio de toronja. 3.4. Metodología 3.4.1. Determinación de la capacidad de biosorción Para determinar la capacidad de biosorción se ha seguido una serie de procedimientos que a continuación se mencionan: 3.4.1.1. Determinación de tratamientos por la Metodología de Superficie de Respuesta  Para la definir los tratamientos se utilizó la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), este método permitió evaluar la influencia de la interacción de las variables independientes (VI) en la biosorción de plomo (II), dando como resultado los valores de la VI que permitió maximizar la variable respuesta (VR) (adaptado de SINGH et al., 2010). 24  Dentro de la MRS se aplicó el diseño de Box-Benhnken para tres factores; se optó por este diseño porque se cree que la variable respuesta no solo está afectada por los efectos directos de los factores, sino también por la misma interacción de estos; situación que ameritó el uso de un diseño de segundo orden o cuadrática, donde las variables de estudio fueron pH, concentración del ion plomo y el peso del biosorbente, con rangos de 3.0-5.20, 49.24-381.80 ppm y 0.05-0.25 g respectivamente (Adaptado de BOX y BEHNKEN, 1960 y SINGH et al., 2010).  Una vez definida los rangos se utilizaron tres niveles para cada factor donde el valor (-1) fue asignado al valor más bajo, (0) al medio y (+1) al más alto, tal como se muestra el Cuadro 3 (GUTIÉRREZ y DE LA VARA, 2008). Cuadro 3. Niveles de tratamientos y valores codificados de factores. Variables Valores para las variables codificadas -1 0 +1 pH 3.0 4.1 5.2 [Pb ppm]] 49.24 219.80 381.80 W biosorbente g 0.05 0.15 0.25 [Pb ppm]: Concentración del ion plomo en la solución. W biosorbente: Peso del biosorbente expresada en gramos.  Luego se hicieron las combinaciones de acuerdo a la matriz del diseño de Box-Behnken (Figura 5), obteniendo 15 tratamientos tal como se muestra en el Cuadro 4. Cuadro 4. Combinaciones de los tratamientos evaluados. Tratamiento Variables independientes Peso de biosorbente (g) Concentración de Pb+2 (ppm) pH 1 0.15 49.24 3.0 25 2 0.15 49.24 5.20 3 0.15 381.8 3.0 4 0.15 381.8 5.20 5 0.05 49.24 4.10 6 0.05 381.8 4.10 7 0.25 49.24 4.10 8 0.25 381.8 4.10 9 0.05 215.52 3.0 10 0.05 215.52 5.20 11 0.25 215.52 3.0 12 0.25 215.52 5.20 13 0.15 215.52 4.10 14 0.15 215.52 4.10 15 0.15 215.52 4.10 Una vez obtenidos los tratamientos; para la evaluación de estos se procedió a preparar el biosorbente. 3.4.1.2. Pretratamiento del mesocarpio de toronja 3.4.1.2.1. Extracción del mesocarpio Las toronjas se compraron del mercado Túpac Amaru-Tingo María, cuya procedencia fue del centro poblado Ricardo Palma, ubicado en el distrito de Padre Felipe Luyando. Posteriormente se realizó un lavado externo del fruto, para luego proceder a la separación del epicarpio (parte externa de color amarilla) de la parte blanca esponjosa que conforma su mesocarpio, dicha separación fue realizada con la ayuda de un cuchillo (Adaptado de SOTO, 2009 y TORAB, 2013). 3.4.1.2.2. Preparación de la biomasa El mesocarpio de toronja se cortó en pequeños trozos y se lavaron tres veces con agua destilada a 60 °C, para no dejar rastros de aceites esenciales y dististas impurezas. Luego se secó en secadora con corriente de aire a la temperatura de 40 °C, despues las trituramos con un molino de cuchilla regulado a 2 mm de diámetro finalmente el polvo adquirido se tamizo con un tamiz 26 de malla 250 µm (TAPIA et al., 2003 y MUÑOS, 2007). Luego se lavó con agua fría tres veces, seguidamente se separó el mesocarpio y se maceró con etanol de 63° por media hora, todo bajo agitación lenta de forma manual, posteriormente se lavó con alcohol de 96° con la finalidad de extraer partículas y polímeros de desecho, y después se secó a 40 °C por 24 horas (MUÑOS, 2007). 3.4.1.2.3. Desmetoxilación de la biomasa Se colocó toda la biomasa triturada (425 g) y tamizada en 2000 mL en una solución de NaOH 0,2M a una temperatura de 4 °C, manteniéndolo con una agitación manual sucesiva por 2 horas. Despues se dejó reposar y se filtró realizando lavados frecuentes con agua destilada para desacer el exceso de NaOH, después se secó en la secadora con corriente de aire a una temperatura de 40 °C por 24 horas (VILLANUEVA, 2006). Figura 6. Diagrama de pretratamiento del mesocarpio de toronja y desmetoxilación. 3.4.1.2.4. Reticulación del mesocarpio Se tomó el mesocarpio desmetoxilado y se puso en 1500 mL de una solución de CaCl2 0,2M, esto se llevó a un pH 5, regulado con HCl 0.1M; manteniendo la mezcla en agitación constante de 200 rpm aproximadamente (agitador magnético), durante 6 horas y después se dejó reposar por 24 horas, todo esto se llevó a cabo a temperatura ambiente (Adaptado de MUÑOZ, 2007; CARDONA et al., 2013). 27 Luego del tratamiento con CaCl2 0,2M se lavó tres veces con agua destilada para eliminar el exceso de cloruro de calcio. Finalmente se filtró con papel filtro N° 40 y se secó en la secadora con corriente de aire a una temperatura de 40 °C por 24 horas, después de esto el biosorbente quedo listo para ser utilizado en el proceso de biosorción (VILLANUEVA, 2006 y MUÑOZ, 2007). Figura 7. Diagrama de reticulación del mesocarpio de toronja. 3.4.1.3. Evaluación de los tratamientos Para evaluar el efecto de cada tratamiento se adaptó la metodología de VILLANUEVA (2006) y MUÑOZ (2007), cuyos procedimientos fueron de la siguiente manera: a. Se diluyó 645.8611 mg de Pb (NO3)2 en 1 L de agua desionizada (AD), para obtener una Solución madre de Pb (II) a una concentración de 400 ppm, y para obtener las demás concentraciones de 219.80 y 49.24 ppm se hizo por dilución. b. Fueron separadas muestras de 25 mL de las soluciones iniciales para almacenarla en refrigeración hasta la lectura en el Espectrofotómetro. c. Luego se separó 50 mL de solución en 1 frasco de vidrio de 130 mL, según a la concentración que requería cada tratamiento. d. Seguidamente se reguló el pH de la solución adicionando HCl 0.05 M, hasta alcanzar el valor que indicaba cada tratamiento. e. Después se pesó el mesocarpio de toronja pretratada según correspondía a cada tratamiento. f. Se añadió el biosorbente y la solución con pH regulada en el Matraz Erlenmeyer de 250 mL, luego se llevó al agitador magnético 28 g. Se mantuvieron los tratamientos bajo agitación constante promedio a 200 rpm durante 3 horas a temperatura ambiente de 26.0 ± 2 °C, hasta alcanzar el equilibrio del sistema. h. Después se filtraron las muestras y se añadió ácido nítrico 1:1 hasta alcanzar un pH<2, para luego ser almacenado en refrigeración a 8 °C (EPA, 1994). i. Finalmente se hicieron la lectura de las muestras y de las concentraciones iniciales en el Espectrofotómetro de Absorción Atómica, para ello se hicieron diluciones de 1:10 y 1:100 para ajustar las concentraciones de Plomo según los rangos de la curva patrón. 3.4.1.4. Cálculo de la capacidad de biosorción Para cálcular la capacidad de biosorción, valor que representa la variable respuesta, se determinó mediante la siguiente relación tomada de BAYO (2012): 𝑞 = 𝑉(𝐶0−𝐶𝑒𝑞) 𝑚 (2) Donde: 𝑞: 𝐶𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑑𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑔. 𝑔−1) 𝑉: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝑙) 𝐶0: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑜𝑚𝑜 (𝑝𝑝𝑚) 𝐶𝑒𝑞: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑜𝑚𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑙𝑖𝑏𝑟𝑖𝑜 (𝑝𝑝𝑚) 𝑚: 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑠𝑜𝑟𝑏𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑔) 3.4.2. Obtención del modelo matemático Una vez obtenidos los datos de la capacidad de biosorción, se evaluó la correlación entre la variable dependiente y las variables independientes. Donde se obtuvo un modelo matemático expresado en función de los términos de un polinomio de segundo orden: 29 (3) Donde Y es la respuesta, Xi las variables, b0 es el coeficiente constante, bi, bii y bij, son los coeficientes de interacción, lineales y cuadráticos respectivamente que evalúan los efectos de los factores. Los parámetros de coeficiente de regresión de los polinomios de respuesta fueron estimados por un modelo de regresión lineal múltiple, validado por la prueba de F y un análisis de varianza; el modelo también fue analizado mediante el diagrama de Pareto, diagrama de probabilidad normal de residuales que se realizaron en el software STATGRAPHICS Centurión XVII, con Licencia de prueba. Las gráficas de superficie de respuesta se obtuvieron a partir del polinomio generado (Adaptado de JARAMILLO et al., 2013). 3.4.3. Maximización de la biosorción Para maximizar la biosorción, se simuló en el software estadístico Statgraphics Centurion XVI.I, para obtener las condiciones óptimas de operación a través del modelo matemático; una vez obtenido la combinación de las variables independientes, se procedió a verificar mediante experimentación si es que estas condiciones de las variables independientes, daban el mismo valor de la variable respuesta tal como resultaba la simulación; si es que el estimado era cercano al valor obtenido, entonces el modelo representaba correctamente los datos y con ella se logró la optimización (Adaptado de VARALA et al., 2016. 30 IV. RESULTADOS 4.1. Determinación de la capacidad de biosorción de Pb+2 El tratamiento con mayor capacidad de biosorción dentro del proceso fue el T7, con una adsorción promedio de 201,887 mg de Pb+2/g de biosorbente (Cuadro 5). Cuadro 5. Concentraciones de equilibrio y capacidad de biosorción. Trat. Concentración final de Pb+2 (mg/L) Biosorción de Pb+2 (mg/g) R1 R2 R3 R1 R2 R3 Promedio T1 21.100 19.720 13.550 72.140 72.416 73.650 72.735 T2 23.390 10.590 4.003 39.282 41.842 43.159 41.428 T3 8.710 5.930 5.630 40.530 43.310 43.610 42.483 T4 6.580 7.400 9.480 14.220 13.947 13.253 13.807 T5 0.872 0.623 1.320 16.123 16.206 15.973 16.101 T6 50.680 33.580 32.310 110.373 116.073 116.497 114.314 T7 16.750 12.830 24.160 203.050 206.970 195.640 201.887 T8 9.290 17.540 21.200 70.170 67.420 66.200 67.930 T9 207.300 192.600 320.200 174.500 189.200 61.600 181.850 T10 165.400 173.700 168.900 54.400 46.100 50.900 50.467 T11 143.300 67.450 58.570 25.500 50.783 53.743 52.263 T12 17.060 33.120 25.290 67.580 62.227 64.837 64.881 T13 52.790 65.970 52.720 109.670 105.277 109.693 108.213 T14 2.031 5.100 7.220 9.442 8.828 8.404 8.891 T15 15.090 22.250 17.840 40.942 39.510 40.392 40.281 R1, R2 y R3 son las repeticiones de los tratamientos. El proceso de biosorción estuvo determinada por el comportamiento de las variables independientes (Figura 8). La variable respuesta estuvo 31 favorecida cuando se tenía altas concentraciones de Pb+2, bajos valores pH y peso de biosorbente. Figura 8. Comportamiento de las variables independientes en el proceso. 4.2. Modelo matemático del proceso de biosorción de Pb+2 Para definir el modelo matemático es necesario conocer cómo se comportan estadísticamente cada factor e interacción del modelo, estos se plasman en los cuadros siguientes: Cuadro 6. Efecto, desviación estándar y coeficientes de los factores e interacciones. Fuente Efecto Error Estd. Coeficiente Promedio 60.7548 4.21607 410.673 A:Concentración de Pb(II) 98.0852 5.14723 0.448829 B:pH -36.5714 5.1648 -102.547 C:Peso de Biosorbente -78.8718 5.1648 -2108.12 AA -2.03512 7.49041 -3.7376E-05 AB 3.18027 7.24526 0.00876108 AC -37.6367 7.24526 -1.14051 BB 9.43942 7.60087 3.90059 Concentración de Pb(II) 55.0 385.0 pH 3.0 5.2 Peso de Biosorbente 0.05 0.25 B io s o rc ió n d e P b ( II ) 0 20 40 60 80 100 120 32 BC 76.2835 7.30268 346.743 CC 36.2014 7.60087 1810.07 Cuadro 7. Análisis de varianza de los factores e interacciones del modelo. Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón- F Valor-P A:Concentración de Pb (II) 19365.3 1 19365.3 363.13 0.0027 B:pH 2673.88 1 2673.88 50.14 0.0194 C:Peso de Biosorbente 12436.6 1 12436.6 233.2 0.0043 AA 3.9367 1 3.9367 0.07 0.8113 AB 10.2751 1 10.2751 0.19 0.7036 AC 1439.06 1 1439.06 26.98 0.0351 BB 82.2485 1 82.2485 1.54 0.3402 BC 5819.17 1 5819.17 109.12 0.009 CC 1209.73 1 1209.73 22.68 0.0414 Residuo 3180.038 5 1077.789 Falta de ajuste 3073.38 3 1024.46 19.21 0.0499 Error puro 106.658 2 53.3291 Total (corr.) 46297.6 14 R2 = 93.1313 % R2 (ajustada) = 80.7677 % Se ve que los principales factores, como las interacciones AC, BC y CC, son significativas en cuanto al nivel de confianza del 95% (p<0,05). Además, el modelo ajustado mustra un coeficiente de correlación R2=80,77 %. De esta manera, se confirma que el modelo para el diseño de superficie de Box-Behnken presenta una pequeña curvatura, debida, en su mayor parte, al aporte significativo del efecto del término cuadrático CC. También se puede ver que la prueba de Falta de ajuste no es significativa (p=0,0499), indicando que el modelo no ajusta los datos de manera adecuada. Con la finalidad de determinar cada factor y su interacción, en la Figura 9, se encuentra la gráfica de probabilidad normal de los efectos estandarizados para la biosorción. 33 Figura 9. Probabilidad normal de los efectos estandarizados. Esta puede dividirse en dos regiones, la región debajo del 50 %, donde los factores y sus interacciones presentan coeficientes negativos (B, C, A2 y AC) y la región sobre el 50 % donde los factores presentan coeficientes positivos (AB, B2, C2, BC y A). Los factores e interacciones que estan alejadas de la línea son significativos, en cuanto a los que están sobre la línea no son significativos. Los valores positivos de los efectos indican una relación directa proporcional entre la variable respuesta y el efecto que se incremente; y sucediendo lo contrario con los valores negativos de los efectos. El diagrama de Pareto de efectos muestra la magnitud e importancia del efecto (Biosorción de Pb), para ello la línea de referencia trazada representa el valor absoluto de los efectos; cualquier efecto que se extienda más allá de esta línea de referencia es potencialmente importante. Por lo tanto, en esta Figura se muestra que los términos A, C, BC, B, AC y la relación CC tienen un efecto significativo (α=0,05) en la variable respuesta del modelo y asimismo muestra que la variable con mayor efecto sobre la biosorción es la concentración de Pb+2. -4.5 -2.5 -0.5 1.5 3.5 5.5 7.5 Efectos estandarizados 0.1 1 5 20 50 80 95 99 99.9 P o rc e n ta je C:Peso de Biosorbente B:pH AC AA AB BB CC BC A:Concentración de Pb(II) 34 Figura 10. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados con p=0,05. En la Figura 11, se evidencia la muestra de la asignasion de los valores residuales, los cuales son considerados la diferencia entre los valores ajustados (modelo) y los valores observados (experimentales). También se observa que los residuos siguen una distribución normal, en la que la mitad toma valores positivos (sobre el 50%) y la otra mitad toma valores negativos (bajo el 50 %). Tambien, se aprecia una ligera desviación en los extremos para los valores del modelo. Figura 11. Probabilidad Normal de los residuos. La Figura 12 muestra la trama tridimensional de superficie para la biosorción de plomo como una función del pH y del peso del biosorbente. Se aprecia que el pH y peso del biosorbente tienen un efecto negativo cuando estos 0 4 8 12 16 20 Efecto estandarizado AA AB BB CC AC B:pH BC C:Peso de Biosorbente A:Concentración de Pb(II) + - Gráfica de Probabilidad Normal para Residuos -23 -13 -3 7 17 27 Residuos 0.1 1 5 20 50 80 95 99 99.9 P o rc e n ta je 35 aumentan y su influencia es relativamente menor que la observada por la variable A. Figura 12. Diagrama tridimensional de superficie para la biosorción de Pb (II) usando mesocarpio de toronja. La biosorción de plomo usando mesocarpio de toronja se ajusta a la Ecuación (4) obtenida por el diseño estadístico. Utilizando este modelo, se puede alcanzar una biosorción máxima promedio de 241,945 mg/g bajo las condiciones analizadas. A: Concentración de Pb (ppm) B: pH C: Peso de biosorbente (g) Biosorción de Pb (II) = 410.673 + 0.448*A - 102.547*B - 2108.12*C - 0.000037*A2 + 0.0087*A*B - 1.140*A*C + 3.900*B2 + 346.743*B*C + 1810.07*C2 (4) Donde los valores de las variables son detallados en sus unidades originales. La anterior ecuación es válida para los rangos analizados de las variables independientes y a una velocidad promedio de agitación de 200 rpm. 4.3. Maximización de la biosorción 36 El Cuadro 8 se aprecia la compocision de los niveles de los factores, que maximizan la biosorción de plomo sobre la región indicada, teniendo como meta: maximizar biosorción de Pb (II), el valor óptimo sería 241,945 mg/g. Cuadro 8. Valor óptimo para maximizar la biosorción. Factor Bajo Alto Óptimo Concentración de Pb 49.24 381.8 379.922 pH 3.0 5.2 3.01316 Peso de biosorbente 0.05 0.25 0.0501778 La diferencia de valor entre el estimado y el observado es de +1,2, esta diferencia demuestra la imprecisión de ajustar las variables independientes a los valores propuestos para la optimización, además el óptimo de biosorción indica que se podía llegar más o menos que este valor (Cuadro 9). Cuadro 9. Verificación del valor óptimo. Variable Valor estimado Valor observado Biosorción de Pb (II) mg/g 241.945 243.145 El modelo matemático permite predecir superficie de respuestas en función del comportamiento de las variables independientes, dentro del rango trabajado para cada una de ellas, tal como muestra las Figura 12, la superficie donde la respuesta se puede maximizar en función del valor óptimo de la concentración de plomo. 37 V. DISCUSIÓN La capacidad de biosorción de Pb (II) con mesocarpio de toronja es una propiedad que tiene el biosorbente por su contenido de pectina, la diferencia con los otros biosorbentes está en la cantidad que cada uno adsorbe, esta variación se ve influenciado por el manejo del cultivo de la fruta, ya que esto influye en la cantidad y calidad de pectina en las diferentes partes de la planta (BRAVERMAN, 1977). En el estudio se tuvo una capacidad promedio de biosorción de 201.88 mg/g (Cuadro 5), cantidad superior respecto a lo que reporta GARCIA et al., (2011). Esta capacidad de biosorción se le atribuye por el pre tratamiento del mesocarpio y por las condiciones de operación de la solución acuosa. Sin el pre tratamiento del biosorbente el valor de biosorción obtenido no hubiera sido posible, ya que este ayuda a disminuir el grado de metoxilación, proceso que aumenta la presencia de grupos carboxilos en la pared celular del biosorbente, siendo estos grupos responsables de la adsorción de iones metálicos (BALARIA y SCHIEWER, 2008); los bajos valores de biosorción alcanzado se puede ver en el estudio de BAYO (2012), quien obtuvo una biosorción cerca de 12 mg/g, removiendo Pb (II) con toronja sin tratamiento, esto demuestra que el pre tratamiento del biosorbente aumenta la capacidad de biosorción de iones metálicos. Así mismo, las características fisicoquímicas de la solución acuosa de Pb+2 también influyeron en la capacidad de biosorción, siendo las de mayor influencia las variables independientes estudiadas; donde la variable más influyente del proceso de biosorción fue la concentración de Pb+2, seguido por el peso del biosorbente y la interacción del peso y pH (Figura 10), resultado 38 contradictorio frente a los estudios de MUÑOZ (2007) y GARCES y COAVAS (2012), quienes obtuvieron que el pH (4-5) es el factor dominante en el proceso de biosorción, este poder dominante se debe que a valores bajos de pH existe una gran cantidad de iones hidronio H3O+ las cuales compiten con el Pb+2 por los sitios activos del biosorbente (VILLANUEVA y TAPIA, 2005), y a valores de pH>5 el plomo precipita (GARCIA et al., 2011), por lo que el manejo de un pH adecuado permitirá maximizar la biosorción. La dominancia de la concentración de plomo en el proceso no tiene una explicación científica, ya que este no condiciona a las demás variables, siendo el único motivo la relación directamente proporcional (Figura 8) entre la biosorción y la concentración de Pb+2, resultado obtenido por SCHIEWER y BALARIA (2009), cada que aumentaba la concentración de iones, si es que tenía el peso adecuado de biosorbente, la biosorción también aumentaba, además la concentración de Pb+2 solamente puede producir saturación en el sistema; en realidad el factor dominante fue el pH, sino que su efecto estuvo enmascarado por los iones de Ca+2 desplazados del biosorbente al momento de adsorción del Pb+2, esto fue comprobado por YUVARAJA et al. (2014), quien mediante un análisis de microscopia electrónica de barrido al biosorbente antes y después de la biosorción, descubrió que los iones Ca+2 después del proceso ya no estaban presente en el biosorbente sino que se encontraban en la solución acuosa, ya sea en su forma libre o formando otro compuesto; por lo tanto en el estudio, este desprendimiento de iones de Ca+2 provocó un aumento del pH de la solución y por consiguiente favoreció a los tratamientos cuyos pH inicial fueron los más bajos, de modo que fueron aumentando hasta alcanzar el rango optimo (4-5) y pudiera darse la adsorción sin interferencia; por otro lado los tratamientos que iniciaron con pH altos no tuvieron buenos resultados porque aumento el pH y condujo a la precipitación de los iones de Pb+2. Por último, la capacidad de biosorción pudo verse afectado por otras variables no controladas, tales como la temperatura, ya que en el estudio hubo un aumento de 4-5 °C debido al calentamiento del agitador, por lo que este 39 aumento pudo afectar a la estructura del biosorbente, tal como menciona WEPPEN y HORNBURGUG (1995), que la temperatura tiene diferente efecto según al sitio activo del biosorbente. Por otro lado, TEJADA et al (2015), menciona que no únicamente el pH tiene influencia en el proceso de biosorción, sino también el tamaño de partícula y la presencia de otros iones metálicos; del mismo modo la interacción de los factores, la especie química que contiene el metal y de la selectividad del biosorbente (CARDONA et al., 2013). Y finalmente, se observa que el biosorbente es eficiente, porque aun teniendo contenido de iones de Pb+2 en sus paredes (Figura 31), pudo alcanzar remociones de hasta 98 %. La aceptabilidad de un modelo se mide de acuerdo al valor que toma el coeficiente de determinación (R2), valor que demuestra la proporción de variación de la respuesta que es explicada por las variables independientes, en el estudio el valor del mismo fue R2=93.13 % (Cuadro 7), valor que indica que hay alto ajuste de los datos hacía el modelo, asimismo el R2 ajustado cuyo valor es 80.76 %, valor que permite comparar el modelo con el estudio de SINGH et al. (2010), quien obtuvo un R2 ajustado = 96.99 % en biosorción de plomo (II) utilizando como biosorbente a Trichoderma viride con 4 variables independientes, la diferencia del valores en R2 ajustado se debe al número de factores utilizados, tal como menciona MARTINEZ (2005), el número de variables explicativas condicionan el valor de R2, mientras más variables tenga el modelo el valor de R2 será cercano a 1. También esta diferencia se ve influenciada por la existencia de términos del modelo cuyos coeficientes con valores bajos y negativos, y además por considerar dos términos cuadráticos que no son significativos en el modelo, pero esto se podría mejorar si se quitaran estos términos de menos influencia, solo que se alteraría la estructura del modelo original del diseño utilizado. En el modelo también se tuvo una prueba de falta de ajuste no significativo, demostrando que los datos no están representados correctamente por el modelo cuadrático del diseño de Box-Behnken, sino que 40 podría haber otro diseño que puede ser cuadrático o lineal con un modelo que ajuste mejor los datos y además pueda dar valor de R2 cercano al 1. Según el rango estudiado de las variables independientes, la optimización, cuyo objetivo es maximizar la biosorción con un valor de 241.945 mg/g (Cuadro 9), valor que no se alcanzó con exactitud, sino que hubo una pequeña variación que estuvo influenciado por la imprecisión de alcanzar los valores óptimos de las variables a la hora de experimentar y por el mismo error que el modelo presenta, pero aun así se ha llegado cerca de la región óptima, tal como muestra la gráfica de superficie (Figura 12) el valor óptimo está cerca del pico, lo cual indica que si se amplía el rango de estudio se puede obtener valores más altos para la biosorción, demostrando que no ha sido un criterio apropiado tomar estudios previos para definir los rangos de estudio ya que cada materia prima (mesocarpio de toronja) varia su composición de acuerdo a mucho factores. 41 VI. CONCLUSIONES El estudio indica que el mesocarpio de toronja (cuya composición contiene pectina) tratada por el método utilizado en este trabajo, le da una buena capacidad de biosorción, a pesar del contenido de plomo que se encontró en el mesocarpio, por lo que podría ser indicado para su utilizacion como biosorbente en procesos de depuración de efluentes acuosos. El análisis estadístico del modelo matemático de segundo orden del proceso de biosorción de Pb (II) con mesocarpio de toronja, ajusta los datos correctamente con un R2=93.13 % y una prueba de falta de ajuste no significativa para α=5% de confianza, indicando que un modelo diferente al cuadrático puede representar mejor el proceso de biosorción. La maximización de la biosorción fue exitosa, debido a que el modelo matemático permitió hallar la configuración que maximice la biosorción dentro de los rangos estudiados de las variables independientes, mostrando un valor máximo para la capacidad de biosorción de 241.945 mg/g, con una desviación de +1.2 entre el valor predicho y el valor observado. 42 VII. RECOMENDACIONES Aprovechar la abundancia de residuos de la industria cítrica para producir biosorbentes y sean usados en el tratamiento de agua de efluentes industriales. Utilizar otra alternativa de método fisicoquímico para el pre tratamiento de la biomasa muerta, con la finalidad de aumentar la capacidad de biosorción. Utilizar métodos de extracción de pectina para cítricos, y sean utilizados estos como biosorbentes con mejoras en el proceso de reticulación. Investigar referente a otros métodos de reticulación o entrecruzamiento para el proceso de adsorción e intercambio iónico. Investigar referente a la selectividad del biosorbente en una mezcla de iones metálicos. Utilizar otros métodos de la Metodología de Superficie de Respuesta para la optimización de la biosorción. Realizar estudios sobre la cinética del proceso de biosorción con mesocarpio de toronja. Investigar otras fuentes biológicas con contenido de pectina y hacer un estudio comparativo de resultados. Investigar sobre técnicas de liberación y recuperación del metal capturado por el biosorbente. Realizar estudios en flujo continuo en columnas de lecho fijo, para evaluar la factibilidad de la aplicación del material en este tipo de sistema VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUSTI, M. 2003. Citricultura; Anatomía de los cítricos. 2 ed. España, Mundi- Prensa. p. 61-81. [En línea]: Google, (https://books.google.com.pe/books?id=YR9fAwAAQBAJ&pg=PA65&dq= anatomia+de+citricos&hl=es- 419&sa=X&ved=0ahUKEwifuL7Ejb7WAhXFSyYKHX7- BD8Q6AEIQzAG#v=onepage&q=anatomia%20de%20citricos&f=false, books, 24 Jul. 2017). 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Pesado del biosorbente para ser usado en el proceso. Figura 22. Regulación del pH a los valores establecidos. 58 Figura 23. Corrida de los tratamientos con sus tres repeticiones. Figura 24. Vista de biosorbente y solución problema después del proceso. 59 Figura 25. Filtrado de las muestras después del proceso. Figura 26. Biosorbente conteniendo Pb(II) en filtro. 60 Figura 27. Refrigeración de las muestras a 8 °C. Figura 28. Dilución de las muestras en 1/10 y 1/100. 61 Figura 29. Espectrofotómetro de absorción atómica utilizado para la lectura de las muestras. 62 B. Datos y documentos complementarios. Cuadro 10. Datos consolidados de porcentaje de remoción y biosorción de plomo por mesocarpio de toronja. Trat. Concentración de Pb pH W de biosorbente Lectura final de Pb (ppm) Remoción de Pb (%) Biosorción de Plomo (mg/g) R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 (ppm) (g) T1 381.8 4.10 0.25 21.100 19.720 13.550 94.474 94.835 96.451 72.140 72.416 73.650 T2 219.8 5.20 0.25 23.390 10.590 4.003 89.359 95.182 98.179 39.282 41.842 43.159 T3 49.24 4.10 0.05 8.710 5.930 5.630 82.311 87.957 88.566 40.530 43.310 43.610 T4 49.24 5.20 0.15 6.580 7.400 9.480 86.637 84.972 80.747 14.220 13.947 13.253 T5 49.24 3.00 0.15 0.872 0.623 1.320 98.229 98.735 97.319 16.123 16.206 15.973 T6 381.8 5.20 0.15 50.680 33.580 32.310 86.726 91.205 91.537 110.373 116.073 116.497 T7 219.8 3.00 0.05 16.750 12.830 24.160 92.379 94.163 89.008 203.050 206.970 195.640 T8 219.8 4.10 0.15 9.290 17.540 21.200 95.773 92.020 90.355 70.170 67.420 66.200 T9 381.8 4.10 0.05 207.300 192.600 320.200 45.705 49.555 16.134 174.500 189.200 61.600 T10 219.8 5.20 0.05 165.400 173.700 168.900 24.750 20.974 23.157 54.400 46.100 50.900 T11 219.8 4.10 0.15 143.300 67.450 58.570 34.804 69.313 73.353 25.500 50.783 53.743 T12 219.8 4.10 0.15 17.060 33.120 25.290 92.238 84.932 88.494 67.580 62.227 64.837 T13 381.8 3.00 0.15 52.790 65.970 52.720 86.173 82.721 86.192 109.670 105.277 109.693 T14 49.24 4.10 0.25 2.031 5.100 7.220 95.875 89.643 85.337 9.442 8.828 8.404 T15 219.8 3.00 0.25 15.090 22.250 17.840 93.135 89.877 91.884 40.942 39.510 40.392 65 Figura 30. Resultados de análisis de plomo en muestras (procedencia de material biologico, Ricaldo Palma - Km 51) tratadas. 66 Figura 31. Resultados del análisis de plomo en el mesocarpio de toronja y el método utilizado para su análisis. 67 68 Fuente: GUTIERREZ y DE LA VARA, 2008 Figura 32. Matriz del Diseño de Box-Behnken para tres factores. 69