UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES CAPACIDAD BIODEGRADADORA DE PETRÓLEO POR MICROORGANISMOS AISLADOS DE UNA REFINERIA Tesis Para optar el título profesional de: INGENIERO AMBIENTAL PRESENTADO POR: RANDY ORHIEL RAMOS ALVAREZ 2020 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL CAPACIDAD BIODEGRADADORA DE PETRÓLEO POR MICROORGANISMOS AISLADOS DE UNA REFINERIA Autor : RANDY ORHIEL RAMOS ALVAREZ Asesor : Dr. CESAR SAMUEL LÓPEZ LÓPEZ Programa de investigación : Biorremediación y recuperación de ambientes degradados Línea de investigación : Ciencias y Tecnologías Ambientales Eje temático de investigación : Remediación Microbiana Lugar de Ejecución : Laboratorio de Microbiología FRNR UNAS - Tingo María Duración : Fecha de inicio : 24 de Junio del 2019 Fecha de término: 25 de Diciembre del 2019 Financiamiento : S/. 7,474.90 FDU : No Propio : Si Otros : No 2020 DEDICATORIA A Dios por permitirme alcanzar mis objetivos, metas trazadas y haberme brindado salud, sabiduría y las fuerzas necesarias para ejecutar esta tesis. A mis queridos padres ZENAIDA SOFIA ALVAREZ BALDEON y EFRAIN RAMOS INGA por su apoyo incondicional a través del tiempo, y por ser los pilares fundamentales en mi formación y motivación para lograr todo lo alcanzado. A mi hermana ANAIS por el apoyo y la inspiración de poder realizar este trabajo, y a mis Familiares por el apoyo motivacional para el desarrollo de la presente tesis. AGRADECIMIENTOS A Dios por las por brindarme salud y el conocimiento necesario para poder realizar mi presente investigación y poder superar ciertas limitaciones que he superado a través del tiempo. A la UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA por formarme como un profesional al servicio de la sociedad a la cual velaré. A mis docentes de la escuela profesional de Ingeniería Ambiental, por orientarme e impartir sus saberes y experiencias durante mi formación. A mis padres, hermana y familiares los cuales fueron de mucha fortaleza e inspiración en poder lograr está presente investigación Al Dr. MSc. Mcblgo. César Samuel López López por su gran apoyo en su asesoría y apoyo en la realización del presente trabajo de investigación, a los señores miembros del jurado calificador: MSc. Víctor Manuel Beteta Alvarado, Mcblgo MSc. Luis Alberto Sánchez Romero, y MSc. Abby Solange Cruz Rodriguez por sus sugerencias en el presente trabajo. A los técnicos de los laboratorios el Ing. Richard Sías Rodríguez, Ing. Neira y la Sra. Glelia Rios; por apoyo en ejecutar la parte operativa y análisis en la presente tesis. A mis amigos (Enrique, Jimmy, Luis Antonio, Julio Cesar, Damila, Jhajaira, Erika, Miriam, Kevin, José, Juan Carlos, Elvis, Aldo, Angelica, Brian B., y Christian R.) por su apoyo tanto su motivación y en el desarrollo de la presente tesis. ÍNDICE GENERAL Página I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………1 1.1. Objetivos…………………………………………………………………….3 Objetivo general……………………………………………………….3 Objetivos específicos………………………………………………....3 II. REVISIÓN DE LITERATURA………………………………………………………4 2.1. Antecedentes de derrame de petróleo …………………………………...4 2.2. Biorremediación…………………………………………………………….5 2.2.1. Microorganismos biorremediadores ………………………………..6 2.2.2. Factores que afectan la biodegradación…………………………….7 2.2.3. Composición química y densidad del contaminante……………….8 2.2.4. Condiciones de operación…………………………………………..11 2.2.5. Evaluación de la eficacia de los biotratamientos………………….14 2.3. Características del suelo…………………………………………………15 2.3.1. Propiedades físicas………………………………………………….15 2.3.2. Propiedades químicas……………………………………………...26 2.3.3. Propiedades microbiológicas……………………………………….42 2.4. Biorreactores………………………………………………………………44 2.4.1. Biorreactor de Air Lift………………………………………………...45 2.4.2. Componentes que afectan en proceso de operatividad en los biorreactores Air Lift………………………………………………...45 2.5. Calidad del suelo………………………………………………………….48 2.5.1. Erosión de los suelos………………………………………………..50 2.6. Procesos en remediación………………………………………………...52 2.6.1. Procesos de remediación biológicas………………………………52 III. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………….57 3.1. Zona de realización……………………………………………………….57 3.1.1. Ubicación política…………………………………………………….57 3.2. Factor climatológico y geográficos………………………………………58 3.2.1. Tiempo………………………………………………………………..58 3.2.2. Geología…………………………………...…………………………59 3.2.3. Geomorfología……………………………………………………….59 3.3. Metodología………………………………………………………………..59 3.3.1. Fase recolección de información…………………………………...59 3.3.2. Fase de campo……………………………………………………….60 3.3.3. Fase de gabinete…………………………………………………….61 3.4. Unidad experimental……………………………………………………...61 3.5. Determinación de las propiedades físicas, químicas y biológicas……62 3.5.1. Determinación de las propiedades físicas del suelo……………..62 3.5.2. Determinación de las propiedades químicas del suelo…………..64 3.5.3. Determinación de las propiedades biológicas del suelo………….68 3.5.4. Aislamiento de bacterias del suelo contaminado con petróleo…..70 3.5.5. Identificación de géneros microbianos en suelos contaminados con petróleo refinado………………………………71 3.5.6. Selección de microorganismos degradadores del Petróleo refinado……………………………………………………. 77 3.5.7. Selección/elección de organismos para uso biotecnológico…….78 3.6. Preparación de biorreactores air lift……………………………………..80 3.6.1. Operación en los biorreactores……………………………………..81 3.7. Diseño de investigación…………………………………………………..82 3.7.1. Ajuste estadístico……………………………………………………….85 IV. RESULTADOS……………………………………………………………………86 4.1. Determinación de las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo………………………………………………………86 4.1.1. Determinación de las propiedades físicas en el suelo……………86 4.1.2. Determinación de las propiedades químicas en el suelo………..89 4.1.3. Determinación de las propiedades biológicas en el suelo……….91 4.2. Identificación de los géneros de las bacterias presentes en el suelo………………………………………………………………………..94 4.2.1. Reconociendo de las bacterias…................................................94 4.3. Selección y elección de las bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo en el suelo……………………………………………..95 4.3.1. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la primera repetición…………………………………………………………….95 4.3.2. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la segunda repetición……………………………………………………………..96 4.3.3. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la tercera repetición…………………………………………………………….98 4.4. Determinación de la eficiencia de la biorremediación de un suelo contaminado con petróleo usando el biorreactor Air Lift……….99 4.4.1. Determinación de la eficiencia del biorreactor Air Lift……………99 4.4.2. Datos obtenidos de los biorreactores en operación y la correlación entre los parámetros medidos……………………….102 4.4.3. Correlación de variables…………………………………………...104 4.5. Análisis estadístico………………………………………………………106 V. DISCUSIÓN………………………………………………………………………110 VI. CONCLUSIONES……………………………………………………………….116 VII. RECOMENDACIONES………………………………………………………..117 VIII. ABSTRACT…………………………………………………………………….118 IX. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA……………………………………………..119 ANEXOS………………………………………………………………………135 ANEXO A. Análisis estadísticos……………………………………………..136 ANEXO B. Identificación de presencia y ausencia de los microorganismos en la primera repetición…………………….141 ANEXO C. Selección de placas para la realización de pruebas bioquímicas……………………………………………………..142 ANEXO D. Pruebas de diferenciaciones bioquímicas de las bacterias….143 ANEXO E. Prueba del Modelo Aditivo Lineal………………………………145 ANEXO F. Formula del Medio Mínimo de Sales de Davis………………..146 INDICE DE CUADRO Cuadro Página 1. Registro de microorganismos aislados en suelos contaminados ………………7 2. Parámetros que dependen de un sistema eficaz de biorremediación………..14 3. Categorías de permeabilidad de los suelos……………………………………..15 4. Métodos de medición de la conductividad hidráulica…………………………..17 5. Clases de las conductividades Hidráulicas……………………………………...18 6. Clasificación de la cantidad de los moteados…………………………………..20 7. Categorización del tamaño de los moteados……………………………………21 8. Categorización del contraste del moteado………………………………………21 9. Categorización entre la matriz y los moteados………………………………….22 10. Consistencia del suelo en seco…………………………………………………23 11. Firmeza de la masa del suelo húmedo o fresco……………………………….24 12. Clasificación de la adhesividad del suelo………………………………………25 13. Categorización de la flexibilidad o plasticidad de los suelos…………………26 14. Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo…………………………31 15. Categorización de los suelos de sus cationes Intercambiables……………..38 16. Niveles de CICE en el suelo……………………………………………………..39 17. Tabla con la interpretación de los análisis de suelos…………………………40 18. Rangos del potasio según la textura del suelo………………………………..41 19. Rangos del nitrógeno total en el suelo…………………………………………42 20. Relación microbiana y la efectividad biológica………………………………...44 21. Parámetros físicos y químicos para una biorremediación……………………53 22. Coordenada del muestreo del suelo en la refinería…………………………..60 23. Flujograma de procesos para el análisis del suelo contaminado…………….61 24. Variables y operación……………………………………………………………84 25. Propiedades físicas del suelo…………………………………………………...86 26. Propiedades químicas del suelo sin contaminar………………………………89 27. Propiedades químicas del suelo contaminado………………………………..90 28. Concentración de microorganismos en bacterias en el suelo……………….91 29. Concentración de Actinomicetos en el suelo…………………………………..93 30. Reconocimiento de bacterias para el primer muestreo……………………….94 31. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo……….95 32. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo……….97 33. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo……….98 34. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la primera repetición………………………………………………100 35. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la segunda repetición…………………………………………….101 36. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la tercera repetición……………………………………………….101 37. Datos obtenidos de la primera repetición en los biorreactores en operación………………………………………………………………………..102 38. Datos obtenidos de la segunda repetición en los biorreactores en operación………………………………………………………………………..103 39. Datos obtenidos de la tercera repetición en los biorreactores en operación………………………………………………………………………..104 40. Correlaciones entre variables medidas en los biorreactores en operación……………………………………………………………………….105 41. Análisis de Varianza……………………………………………………………106 42. Prueba de Tukey (HSD) con la variable dependiente de Biomasa Microbiana y la variable independiente de Petróleo…………………………107 43. Correlación entre el Petróleo y la biomasa microbiana (M.O)………………109 44. Diseño de análisis de varianza (ANVA)……………………………………….137 45. Diseño de Tukey………………………………………………………………..137 46. Diseño de Correlaciones de Pearson…………………………………………139 47. Escala de índice de correlación de Pearson………………………………….139 48. Rango de interpretaciones de los coeficientes de varianza………………..139 49. Reconocimiento de la presencia o ausencia de bacterias en seis diferentes medios de cultivos de la muestra del suelo………………………141 50. Selección de las placas conforme al crecimiento presentado para cada muestra………………………………………………………………………….142 51. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la primera repetición………………………………………………………………………..143 52. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la segunda repetición………………………………………………………………………..143 53. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la tercera repetición………………………………………………………………………..144 54. Composición para 1L de medio mínimo de sales……………………………146 55. Composición para 1L de la solución traza de elementos……………………146 INDICE DE FIGURAS Figura Página 1. Trayecto metabólico de capacidad degradativa del petróleo……………………9 2. Trayecto de los agregados xenobióticos en el ecosistema…………………….10 3. Recorrido de agregados xenobióticos en el medio……………………………..11 4. Permeámetro de carga variable………………………………………………….18 5. Tipos de productos de petróleo y TPH’s, números de carbonos aproximados y los rangos de puntos de ebullición……………………………..27 6. Dispositivo de extracción Soxhlet………………………………………………..29 7. Período biogeoquímico del cadmio………………………………………………34 8. Transmisión en el suelo con presencia del cadmio……………………………..34 9. Biorreactor en fase líquida………………………………………………………..45 10. Integración de las propiedades físicos, químicos y biológicos en la calidad del suelo………………………………………………………………….48 11. Procedimientos y las propiedades en relación a la eficacia y su sustentabilidad en el suelo………………………………………………………49 12. Mapa de la zona de estudio……………………………………………………..58 13. Cálculo del número de microorganismos por el método de diluciones seriadas…………………………………………………………………………...70 14. Instalación del biorreactor Air Lift……………………………………………….81 15. Diseño experimental……………………………………………………………..83 16. Concentraciones bacterianas en el suelo de la refinería……………………..92 17. Concentraciones de Actinomicetos en el suelo de la refinería……………….93 18. Peso de la muestra……………………………………………………………..147 19. Preparación de la muestra……………………………………………………..147 20. Siembra del cultivo en el agar………………………………………………….148 21. Crecimiento en los medios de cultivos de la muestra de suelo……………148 22. Conteo de microorganismos en el agar Plate Count………………………...149 23. Observación del Bacillus sp. en el microscopio……………………………...149 24. Observación del Bacilos sp. en el microscopio……………………………....150 25. Prueba bioquímica de las bacterias encontradas……………………………150 26. Crecimiento de las bacterias en el Agar Mínimo de Sales Minerales de Davis……………………………………………………………………………..151 27. Inicio del proceso de operaciones en los biorreactores…………………….151 28. Mediciones del pH de los biorreactores………………………………………152 29. Mediciones del OD y °T de los biorreactores…………………………………152 30. Observación del biofilm en el biorreactor……………………………………..153 31. Observación del crecimiento de microorganismos del biorreactor…………153 32. Observación del crecimiento de microorganismos de los biorreactores en los agares para su selección…………………………………………........154 33. Prueba de determinación del hidrocarburo total de petróleo por el Soxhlet…………………………………………………………………………..154 34. Prueba de análisis del boro del suelo…………………………………………155 35. Análisis para determinar la prueba de moteados y consistencia…………...155 36. Prueba de la permeabilidad y conductividad hidráulica del suelo………….156 37. Prueba para la determinación del color del suelo en la tabla Munsell……...156 38. Extractos de muestras de los biorreactores en operación del día 15……..157 RESUMEN Se estudió la capacidad de degradación de microorganismos aislados del suelo de una refinería para determinar su tasa de eficiencia al desarrollar en suelos contaminados con petróleo refinado. Se utilizaron muestras provenientes del suelo de una refinería de la ciudad de Pucallpa, Ucayali. Se aislaron e identificaron microorganismos presentes en la muestra. Se comprobaron las característica físicas y químicas del suelo antes y después de ser contaminado con petróleo y en biorreactores air litf conteniendo concentraciones de 0.25 mL, 0.5 mL, 0.75 mL y 1.0 mL de petróleo refinado se inocularon los microorganismos previamente aislados e identificados encontrándose que la tasa de producción de biomasa es de alrededor del 13 %, bajo condiciones de desarrollo de pH entre 8.2 a 9.0, con O.D. de 0.77 a 3.57 y temperatura entre 27.6 a 30.8 °C, la tasa de eficiencia de degradación (determinada por el desarrollo microbiano) aparentemente es baja en términos de degradación, pero permite a los microorganismos mantenerse viables en los suelos de la refinería a condiciones extremas, estos microorganimos podrían ser procesados adecuadamente con técnicas de modificación genéticas para incrementar su tasa de eficiencia de degradación del petróleo. Los microorganismos identificados pertenecen a los géneros Enterobacter y Serratia y bacterias del grupo de los Actinomicetos. Palabras clave: Petróleo, degradación, biorreactores Air Lift. 1 I. INTRODUCCIÓN La biorremediación es la capacidad de los organismos de multiplicarse gracias a un medio favorable (SHMAEFSKY, 1999, MACK KAY, 2001). Unos cuantos tienen la capacidad de degradar compuestos de CO2, agua, minerales etc. Así generan subproductos que son de poco impacto al ecosistema (ADVANCED BIOTECH, 2019). Esta habilidad permite tratar los agentes alteradores ocasionando un impacto progresivo, en comparación de otras operaciones de purificación (MOLNAA y GRUBBS, 2001). La técnica de remediación es aplicada también in situ o ex situ. Las técnicas in situ son las que se tratan en la zona contaminada a remediar, a diferencia de la técnica ex situ son tratados en un lugar donde puede ser manipulado externamente a la zona contaminada. (GRUIZ y KRISTON, 1995; SHMAEFSKY, 1999; TUTTLE y LESTER, 2001). La remediación se divide en procesos de crecimiento y abundancia de microorganismos. Los procesos de crecimiento contemplan la manipulación de insumos nutritivos para generar un crecimiento microbiano y el desarrollo de los microorganismos idóneos de descomponer cuerpos contaminados en el ambiente (BAHERI y MEYSAMI, 2002; GRUIZ y KRISTON, 1995). 2 El bioaumento describe la inducción de microorganismos a un determinado objeto o material con una intención de prescindir compuestos no deseables (SHMAEFSKY, 1999). También los microorganismos específicos son capaces de biodegradar contaminantes no admitidos hasta sus moléculas (ADVANCED BIOTECH, 2019). Los microorganismos que residen en diversos ambientes sean terrestres y/o acuáticos, según el clima y región geográfica son varios y capaces de utilizar cualquier compuesto orgánico que se encuentre en su contorno. Por lo tanto, estos microorganismos tienen la capacidad de usar el petróleo refinado, como fuente de energía y carbono (MADIGAN et al., 1998). La capacidad de resiliencia de los suelos es limitada, se reprime con la incorporación de residuos, ya sea por las altas concentraciones que retrasan su biodegradación por su condición de residuos (POZZO, 1996). En efecto el problema planteado de este trabajo radica en torno a la siguiente interrogante: ¿Cuál es la capacidad biodegradadora del petróleo por los microorganismos aislados de una refinería? Con relación al problema planteado, se formula la siguiente hipótesis: concerniente que; la capacidad biodegradadora del petróleo por los microorganismos aislados de una refinería es baja. 3 1.1. Objetivos: Objetivo General: - Determinar la capacidad biodegradadora de petróleo por microorganismos aislados de una refinería. Objetivos Específicos: - Determinar las propiedades físicas, químicas y biológicas de un suelo contaminado con petróleo de una refinería - Aislar e identificar los géneros de las bacterias presentes en un suelo contaminado con petróleo. - Seleccionar y elegir las bacterias con capacidad degradadora del petróleo. - Determinar la eficiencia de los microorganismos aislados de un suelo de una refinería para degradar petróleo usando biorreactor Air Lift. 4 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Antecedentes de derrame de petróleo En el 2001, sucedió un derrame de petróleo en el Puerto Eten, también sucedió un 2do accidente de derrame que ocasionó daños a las playas del mismo puerto. En el 2002 sucedió un accidente de derrame de petróleo en Paiñas al norte de Talara. En el 2006 se derramó petróleo diésel, ocasionado por un buque en el Callao. En el 2007 sucedió un derrame en la provincia de Bagua donde se vertieron 100 barriles de petróleo. En el 2009, el oleoducto norperuano que transportaba petróleo hasta la refinería de Pucallpa ocurrió un derrame de petróleo, generando una alteración ambiental a seis kilómetros de la ciudad de Pucallpa (ENERGÍASUR, 2019). Aunque se sabe que los microorganismos degradan los diversos ingredientes presentes en el petróleo refinado, existe la necesidad de aislar nuevos microbios que no solo pueden degradar los componentes principales del aceite, sino que también pueden agotar selectivamente otros compuestos. La mayoría de petróleos son degradables después de su eliminación (HEINONSALO et al., 2000), sin embargo, hay muy poca información disponible sobre la Transformación química de dichos compuestos en condiciones ambientales naturales. El objetivo de la presente investigación será del 5 aislamiento de los microorganismos degradadoras del petróleo refinado y la evaluación de su eficiencia degradativa del petróleo en el suelo. 2.2. Biorremediación La biorremediación, constituye una biodegradación de sustancias orgánicas, sustancias que operan como carbono forzoso para su incremento celular y fuente de energía que necesitan estos microorganismos para su reproducción. Según la Normativa IRAM 29555-1:2003, para diseñar un procedimiento de remediación de estos procedimientos metabólicos, se necesita que el ambiente brinde circunstancias mecánicas, sintéticas y orgánicas favorables tales a conocer lo siguiente: - Es necesario resguardar la subsistencia de bacterias autóctonas con capacidad de usar el petróleo como nicho de carbono y energía. - Es obligatorio que exista en el sistema unos receptores de aniones que se oxiden las fuentes de carbonos que son componentes del petróleo. - Verificar los escenarios óptimos de los parámetros físicos, químicos y biológicos estén en una condición estable. 6 Durante un proceso degradativo se transforma arbitrariamente o en general los agentes contaminadores naturales. En la evolución arbitraria se produce un agregado con menor toxicidad. En una mutación se produce un resultado final de CO2 y H2O en procedimientos con presencia del aire como también en procedimientos sin presencia de oxígeno (BASCO PLA y CASTILLO, 2014). 2.2.1. Microorganismos biorremediadores Estas bacterias, se encuentran en el ecosistema, tienen el contenido de diferentes compuestos tóxicos, sin embargo, su densidad poblacional es limitada en sitios no contaminados y se incrementa en ambientes impactados por un contaminante (NÚÑEZ, 2003; MADIGAN et al., 2004). En el siguiente cuadro 1, se reportan los microorganismos aislados de suelo alterado con petróleo localizados que se encuentra en una cuenca, en el noroeste de la provincia de Río Negro (ALTAMIRANO y POZZO ARDIZZI, 2000). 7 Cuadro 1. Registro de microorganismos aislados en suelos contaminados Género Especie Fuente Micrococcus roseus Tierra alterada sedentarius Tierra alterada varians Tierra alterada spp. Tierra alterada Sphingomonas paucimobilis Tierra alterada Pseudomonas vescicularis Rizósfera Fuente: ALTAMIRANO y POZZO ARDIZZI, 2000 También se destacan hongos con capacidad hidrocarburilítica pertenecientes a los géneros: Acrostalagmus, Penicillium, Ulocladium, Fusarium y Cephalothecium. (POZZO ARDIZZI et al., 1999). 2.2.2. Factores que afectan la biodegradación Un sistema de biorremediación eficiente obedece a la celeridad de descomposición de suelos, por ello se debe tomar en cuenta los componentes abióticos y bióticos. La humedad, temperatura y pH Un microorganismo tiene un aguante a ciertos aspectos ambientales, las cuales son: pH, temperatura y salinidad, donde el efecto es al 8 aumento y la actividad microbiana. En la actualidad no existen parámetros pre- establecidos para una degradación adecuada tales como rangos de temperatura 20-30 °C y el pH entre 6-8 (ALEXANDER, 1961). La diferenciación de los rangos de pH del suelo suele dañar el aumento microbiano como también los contaminantes e iones. El rango pH adecuado para el desarrollo de la degradación es neutro (7,4 - 7,8). El factor de humedad del suelo ocasiona de forma drástica el proceso de degradación de los contaminantes en el suelo (VERSTRAETE et al., 1976). 2.2.3. Composición química y densidad del contaminante Según (ERCOLI et al., 2000), la degradación de un combinado orgánico depende de la capacidad de los microorganismos para usarlo como fuente de carbono, en el lugar de efecto del catalizador degradativa esta estrechado, el efecto no se ejecutará, ocasionando una disminución del efecto degradativo. 9 Figura 1. Trayecto metabólico de capacidad degradativa del petróleo (NÁPOLES ÁLVAREZ, J. y ÁBALOS RODRÍGUEZ, A. 2008). 10 Figura 2. Trayecto de los agregados xenobióticos en el ecosistema (NÁPOLES ÁLVAREZ y ÁBALOS RODRÍGUEZ, 2008) 11 Figura 3. Recorrido de agregados xenobióticos en el medio (NÁPOLES ÁLVAREZ, J. y ÁBALOS RODRÍGUEZ, A. 2008) 2.2.4. Condiciones de operación A. pH El pH del sistema suelo-contaminante-microorganismos más adecuado corresponde a 6 y 8 de rango y el pH neutro se considera óptimo. 12 B. Humedad La humedad puede condicionar de forma severa la biodegradación, el exceso de humedad genera procesos anaeróbicos, la escases retarda el proceso por disminución de actividad y muerte de las células microbianas. Es provechoso conservar una humedad cerca del 60 % de su cabida portante del campo. C. Temperatura Esta influye en la aceleración biodegradativa de las bacterias. Los rangos óptimos oscilan de 15 ºC a 45 ºC, ciertas investigaciones de biodegradación se hicieron con bacterias termófilos excesivos y criófilos (FEITKENHAUER et al., 2003). D. Celeridad de degradación Esta se incrementa con la temperatura, pero no debe pasar los 40 ºC, ocasiona una desvalorización del crecimiento bacteriano por la disolución enzimática y se genera una elección bacteriana de especies tenaces a temperaturas extremas (SEMPLE et al., 2001). E. Disponibilidad del oxígeno En una biodegradación ocurren fuerzas de óxidos y reductores para la generación de energía. El vínculo comienza con la sustancia orgánica, exterior a la célula, que ejerce como librador de aniones. Los receptores de los aniones usados por las bacterias son “el oxígeno, ion nitrato, hierro (III), ion sulfato y el dióxido de carbono (MADIGAN et al., 2004). 13 F. Concentración de nutrientes El metabolismo microbiano requiere de fuentes de macronutrientes: carbono, nitrógeno, fósforo y potasio. Las bacterias son idóneas para ser empleados desde formas oxidativas (CO2) incluso compuestos de polímeros de mayor balance molecular, incluidos compuestos tóxicos. Los compuestos orgánicos se añaden átomos de carbono a la estructura de las células, la cual son una fuente de combustible metabólico, algunos organismos tienen generan su fuente de energía como también otros buscan su fuente enérgica para subsistir (MADIGAN et al., 2004). G. Cantidad microbiana La cantidad de microorganismos es el elemento condicionante para que exista la bio-descomposición. Se requiere la existencia de una cantidad de microorganismos amoldada al medio, donde se tenga enzimas con la finalidad de degradar las reacciones. Este tratado puede realizarse mediante tres mecanismos: - Inducción de enzimas específicas, - Permutas genéticas que mutan en diversas manifestaciones del metabolismo, o - Florecimiento específico para organismos idóneos a fin de convertir un compuesto a estudiar. 14 2.2.5. Evaluación de la eficacia de los biotratamientos La eficacia de un sistema de biorremediación depende de los parámetros que se agrupan en tres categorías. Cuadro 2. Parámetros que dependen de un sistema eficaz de biorremediación Parámetros de control para evaluar la eficiencia de un biotratamiento Tipos de parámetros de los suelos Tipos de parámetros sintéticos Situaciones climatológicas Densidad de la población bacteriana pH del suelo Saturación de los suelos Clima de los suelos Concentraciones de los nutrientes Textura de los suelos Volatilidad Estructura química Concentración Toxicidad Temperatura ambiente Precipitaciones Vientos Humedad relativa Fuente: BELTRÁN et al., 2018 Operativamente, se deben identificar los parámetros que se apartan de los intervalos eficaces que se proporcionan y se debe comprobar que el equipo diseñado y sus descripciones brinden operatividad al equipo y compensen cualquier condición de sitio no adecuada. 15 2.3. Características del suelo 2.3.1. Propiedades físicas: A) Permeabilidad Según GUERRERO (2013), es la intensión de infiltración en el suelo, gracias a la porosidad del suelo, la cual hace el desplazamiento del agua en su interior. La cual se analizará la permeabilidad por el procedimiento del permeámetro de carga variable o continua. En el cuadro 3, se observa las categorías de permeabilidad. Cuadro 3. Categorías de permeabilidad de los suelos Categoría de permeabilidad Rango de permeabilidad Ejemplos de suelos (cm/hora) (cm/día) Muy Pausada < 0.13 < 3.00 Arcilla, clay pan, masivo Pausada 0.13 - 0.60 3 - 12 Arcilla, masivo, limoso Prudentemente lenta 0.60 - 2.00 12 - 48 Francos arcillos limoso Prudentemente 2.00 - 6.30 48 - 151 Francos limosos, francos Prudentemente alígera 0.63 - 12.7 151 - 305 Francos arenosos Rápida 12.7 - 25 305 - 600 Arenas francas, suelto sin estructuras Muy rápida > 25 > 600 Arenas francas gruesas, arenas sueltas, granos simples Fuente: GUERRERO, 2013 B) Conductividad hidráulica Es un parámetro de medición de poros del suelo para ver la 16 permeabilidad, la porosidad y la saturación en el suelo. Ya que ello involucra una diferenciación entre la Permeabilidad Intrínseca y la Conductividad (DONADO, 2004). Procedimiento para determinar la conductividad hidráulica El parámetro de conductividad hidráulica es importante para la simulación de flujos de aguas subterráneas como para determinar la infiltración en el suelo. También se puede calcular la conductividad hidráulica con otros parámetros de medición, pero hay la probabilidad de que la estimación sea errónea gracias a las interrelaciones acuoso-sólido (DONADO, 2004) A continuación, en el Cuadro 4 (YOUNGS, 2001) se observa los siguientes métodos. 17 Cuadro 4. Métodos de medición de la conductividad hidráulica CLASE DE METODO METODO EQUIPO COMENTARIO Procedimiento en el laboratorio con suelos impregnados de agua 1. Permeámetro de carga constante ES Se usan pequeños núcleos y columnas de suelo. 2. Permeámetro de carga variable ES Se usan pequeños núcleos y columnas de suelo. 3. Permeámetro oscilante AE Se usan pequeños núcleos y columnas de suelo. Solo es necesario agregar una pequeña cantidad de agua. Procedimiento en el laboratorio con suelos en parte impregnados de agua 1. Método de infiltración ES Se usan columnas largas de suelo uniformes de suelo uniforme 2. Permeámetro de momento variable AE Se usan columnas largas de suelo de suelo uniforme Procedimiento de campo con nivel freático 1. Hoyo con barrena ES Ejemplares de suelo bajo el nivel freático. 2. Piezométrico ES Ejemplares de suelo en la vecindad de la base abierta. 3. Dos pozos ES Ejemplares de suelos entre las dos perforaciones. 4. Bombeo de pozos EPP Usadas en pruebas de acuíferos a profundidad. 5. Drenaje de tierra ES Ejemplares de suelos entre las surcos de derrame. Procedimiento de campo sin nivel freático 1. Permeámetro de hoyo perforado ES Muestra de los suelos del espacio fresco. 2. Inverso del hoyo con barrena ES Muestra de los suelos del espacio fresco. 3. Permeámetro con entrada de aire AE Muestras de suelo dentro del tubo aislado. 4. Infiltrómetro de disco ES Ejemplares de suelo próximo a la zona superficial. 5. Goteo ES Ejemplares de suelo próximo a la zona superficial. 6. Sorptividad AE Ejemplares de pequeño volumen (también puede clasificarse como un método de laboratorio con suelos parciales 7. Infiltrómetro de presión AE Usado en muestras de baja permeabilidad (también puede clasificarse como un método de campo con nivel freático) 8. Infiltrómetro de doble anillo ES Muestras de suelo cercanas a la superficie. Fuente: YOUNGS, 2001 18 Cuadro 5. Clases de las conductividades Hidráulicas CLASIFICACIÓN CONDUCTIVIDADES HIDRÁULICAS cm/h m/día Desmesuradamente tardía 0.10 0.03 Tardía 0.1 al 0.5 0.03 al 0.12 Prudentemente pausada 0.5 al 2.0 0.12 al 0.50 Ponderada 2.0 al 6.0 0.50 al 1.50 Prudentemente aligerada 6.0 al 12.0 1.50 al 3.00 Aligerada 12.0 al 18.0 3.00 al 4.50 Extremadamente Aligerada > 18 > 4.50 Fuente: SERVICE E.U.A. SOIL CONSERVATION, (2008) Figura 4. Permeámetro de carga variable (BOWLES, 1980) 19 C) Color Según Munsell (1975), la coloración indica la constitución del suelo, como también las condiciones tales como la oxidación y reducción del suelo. Su constitución está hecha por polvos finos de material orgánico húmedo (opaco), óxidos de manganeso (pardos), óxidos de manganeso (negros) y óxidos de fierro (amarillos, pardos, naranja y rojos) como también pueda ser por la roca parental. Según Munsell (1975), las cromas y los valores están visibles para un análisis, no es recomendable el uso de formas redondas, los apuntes deben estar precisas en el uso de los valores intermedios o su adición en un + o -. Las letras minúsculas se usan como sufijos, para calificar a los horizontes principales especificando el carácter dominante de este horizonte. Las letras minúsculas van inmediatamente después de las letras mayúsculas. Las más frecuentes son: - “t” acumulación de arcilla iluvial, (de textura, o sea granulometría). Bt. - “w” horizonte B de alteración, (de weathering = meteorización) reflejada, con respecto al horizonte inferior, por: la arcilla (alto contenido, formada in situ), y/o el color (más rojo o más pardo), y/o la estructura (edáfica, no la de las rocas originales). Bw. - “g” moteado (abigarrado) por oxidación/reducción del Fe. Manchas de colores pardos/rojos y gris/verde. Hidromorfía parcial. Bg Cg y más raramente Ag (EDAFOLOGÍA, 2020) 20 D) Moteados Según Munsell (1975), son imperfecciones de diversos colores con un color predominante al suelo. Dicha coloración indica que el suelo fue alterado como humedecido (reducido) y deshidratación (oxidado). Color de moteados Según Munsell (1975), la determinación de los colores de los moteados se realiza apreciando la tabla de Munsell. Cantidad de moteados Según MUNSELL (1975), la cantidad moteados se expresa en el porcentaje del total de la extensión de los moteados ocupados (véase Cuadro 6). Cuando la cantidad de moteados no permite apreciar una matriz o el color de esta, los colores resaltantes se deberán analizar y grabarse para los colores de la matriz en el suelo. Cuadro 6. Clasificación de la cantidad de los moteados Códigos Cantidad de moteados % N Ninguna 0 V Demasiado poco 0 al 2 F Escasos 2 al 5 C Habitual 5 al 15 M Demasiados 15 al 40 A Demasiado Cuantioso Mayores a 40 Fuente: FAO, 2009 21 Dimensión de moteados El Cuadro 7, se observa las categorías de los tamaños de moteados. Cuadro 7. Categorización del tamaño de los moteados Códigos Categorización de los tamaños de moteados mm MF Demasiado suave Menores a 2 FN Suave 2 al 6 MD Moderado 6 al 20 GR Demasiado resistente Mayores a 20 Fuente: FAO, 2009 Divergencia de moteados La divergencia de los colores entres moteados y su matriz, se observa en el Cuadro 8. Cuadro 8. Categorización del contraste del moteado Códigos Categorización de la divergencia del moteado Descripción F Frágil Los moteados son indiscutibles cuando son observados a simple vista. La relación entre los colores y la matriz del suelo son gracias a los valores, las matrices y las cromas. D Desigual Los moteados son observados con facilidad. Tanto la matriz, el valor y el croma son reconocibles a simple vista. La cual pueden diferenciarse por más de 2.5 componentes de la matriz, el valor o el croma. P Preponderante El reconocimiento de los moteados es por ser claros y por ser el más relevante del horizonte. El valor, el croma y la matriz son distinguibles y variables entre ellas. Fuente: FAO, 2009 22 Demarcaciones de los moteados Según Munsell (1975), la remarcación del grosor en el espacio, del color de la transición puede ubicarse sin necesidad de buscar la matriz del suelo (Véase Cuadro 9). Cuadro 9. Categorización entre la matriz y los moteados Códigos Categorización entre la matriz y los moteados mm S Sutil < 0.5 C Calmoso 0.5 _ 2 D Dudoso > 2 Fuente: FAO, 2009 E) Firmeza Según la FAO (2019), hace referencia a la cohesión del suelo, dependerá mucho del conjunto y tipo de las arcillas, la humedad y el material orgánico. En muchas situaciones, la saturación de la firmeza o consistencia siempre se ha podido detallar, como en situaciones de humedad cuando está seco el suelo, y ocurre ello en la añadidura de agua al suelo. A continuación, véase el Cuadro 10 donde se observa la firmeza del suelo en seco. 23 Cuadro 10. Consistencia del suelo en seco Códigos Consistencia del suelo Descripción DP Desprendido No coherente. BL Blando La abundancia del suelo es muy débil en consistencia y rompible; se vuelve polvo o gránulos en poca presión. LT Levemente tieso Poca resistencia a una coacción; la cual se deshace fácil en las manos. TA Tieso Prudentemente duro a la presión; se deshace fácil en la palma de las manos; a la vez no ocurre esto en los dedos. MT Muy Tieso Grandemente firme a la presión; se deshace fácil entre manos con un poco de dificultad. ET Enormemente Tieso Extremada resistencia a la presión; no se deshace fácil entre las manos. Fuente: FAO, 2009 Firmeza en un suelo fresco o húmedo A continuación, véase el Cuadro 11 donde se observa la firmeza del suelo en húmedo. 24 Cuadro 11. Firmeza de la masa del suelo húmedo o fresco Códigos Firmeza del suelo fresco Descripción DS Desprendido Sin relación. MD Demasiado Disgregable El material de suelo se aplasta bajo presión leve, pero es coherente cuando se lo presiona todo al mismo tiempo. DG Disgregable El material de suelo se aplasta fácilmente bajo presión suave a moderada entre los dedos, y se vuelve coherente cuando se lo presiona junto. EB Estable El material de suelo se aplasta bajo presiones moderadas entre los dedos, pero su resistencia es distintamente evidente. ME Muy Estable El material de suelo se aplasta a presiones fuertes; apenas aplastable entre los dedos. EET Enormemente Estable El material de suelo se aplasta solo a presiones muy fuertes; no puede aplastarse entre los dedos. Fuente: FAO, 2009 Firmeza en suelos húmedos: mucha adhesividad y plasticidad Según la FAO (2009), el suelo depende de su adhesividad en proporción a su disposición del suelo es disruptiva en presencia del agua. Para poder determinarlo se debe analizar en ciertas situaciones estándares en porciones del suelo, cuya disposición está en su totalidad destruida. También se determina la máxima adhesividad y se ve su viabilidad haciendo comparaciones entre otros tipos de suelos (Véase Cuadro 12). 25 Según la FAO (2009), es la destreza del suelo para poder cambiar de forma perpetua bajo influencia de cierta presión y contener dicha forma a pesar de cierta presión. Se analiza realizando un enrollamiento al suelo en los dedos de la mano, hasta crear un cordón de 3 mm de diámetro. (Véase Cuadro 13). Cuadro 12. Clasificación de la adhesividad del suelo Códigos Clasificación de la adhesividad del suelo Descripción NF No es fijado Luego de infringir presión al suelo, tampoco se une a la mano. SST Ligeramente adherente Luego de infringir presión al suelo, tampoco se une a la mano, como también no se despega posteriormente. No se dilata perceptiblemente cuando se alejan de los dedos. FJ Fijado Luego de infringir presión al suelo, tampoco se une a la mano y se extiende al dilatarse al momento de apartarse de la mano. EFJ Exageradamente fijado Al momento de infringir coacción al suelo, se une a la mano, también es evidentemente extensivo, y a la vez se apartan de la mano. Fuente: FAO, 2009 26 Cuadro 13. Categorización de la flexibilidad o plasticidad de los suelos Códigos Categorización de la flexibilidad de los suelos Descripción NFL No es flexible No se perfila una tira del suelo. LFL Levemente flexible Se perfila una tira del suelo, luego se destroza al momento si se realiza de una forma de un aro; el suelo se desfigura con una ligera presión. PL Flexible Se perfila una tira del suelo, luego se destroza al momento si se realiza de una forma de un aro; el suelo se desfigura con una ligera a templada presión. DFL Demasiado flexible Se perfila una tira del suelo, luego se destroza al momento si se realiza de una forma de un aro; el suelo se desfigura con una templada a mucha presión. Fuente: FAO, 2009 2.3.2. Propiedades químicas A) Hidrocarburos totales Según TPHCWGS (1998), el 90 % de la composición del petróleo es difusa de los hidrocarburos, gracias a que son tratadas en refinerías, la cual son destilados y se obtienen una diversidad de subproductos para diferentes aplicaciones. Según ATSDR (2019), la diversidad de productos sintéticos es la conformación de los hidrocarburos en sus derivados, de ello es sencillo aplicar una determinación de hidrocarburos totales que ver por cada compuesto por separado. 27 Figura 5. Tipos de productos de petróleo y TPH’s, números de carbonos aproximados y los rangos de puntos de ebullición (TPHCWGS,1998) 28 Efectos sobre las propiedades físico químicas Según (MARTÍNEZ & LÓPEZ, 2001), los derrames de hidrocarburos generan daños a las propiedades mecánicas (densidad real, densidad aparente, textura y porosidad) y sintéticas (pH, materia orgánica y conductividad eléctrica) sean entre relevantes y no significativas. Efectos en el ser humano Una vez que ha ocurrido un derrame, existen diferentes vías de exposición a estos contaminantes, entre ellas se pueden mencionar: - Contacto dérmico con el suelo contaminado: Afecta al ciclo de nutrientes, invertebrados y plantas, a niños y adultos. - Ingestión del suelo: Los receptores son esencialmente los niños, además puede afectar a herbívoros y a la vida silvestre en general. - Incidencia en aguas superficiales o subterráneas: afecta significativamente la vida acuática, si el agua contaminada es bebida puede presentar riesgos para la población general. - Afecta la producción de carnes o leche. - Las migraciones de los contaminantes afectan al ecosistema y a la población en general. Existen también compuestos como el benceno que incrementan la frecuencia de leucemia, el tolueno que afecta el sistema nervioso, el xileno además de afectar el SNC puede provocar neumonitis, daño renal y hepático. 29 Método Soxlet Según (USEPA 1996; SZOLAR et al., 2002; DOF, 2006; PARRA et al., 2014), este método tiene por finalidad la extracción cíclica sólido-líquido, que transfiere un analito de una matriz, respecto a sustancias orgánicas su afinidad depende de los polos de esta. Al elegir un solvente se debe aplicar en la extracción y las circunstancias de la operatividad del equipo, la eficiencia de la extracción por el solvente dependerá del tiempo de la operatividad del equipo en las muestras de suelos. Luego se determinó la gravimetría aplicando los métodos D5369-93 (ASTM, 2003) y la US EPA 1996 (3540C) y la US EPA 1994 (3541). Figura 6. Dispositivo de extracción Soxhlet (CELA et al., 2002) Legislatura ambiental en referencia a la calidad del suelo Según el MINAM (2017), en la legislatura ambiental se pretende 30 prevenir la alteración de forma negativa al suelo, que se fundamenta en buenas prácticas ambientales en cada proceso productivo, la cual se tiene la finalidad de evadir la contaminación de los recursos naturales. Según el MINAM (2017), en el Perú, el Estándar de Calidad Ambiental para el suelo – D.S. N° 011-2017, se precisa la congregación o concentración de los parámetros mecánicas, sintéticos y orgánicos en el suelo; en su condición de receptor, que no presenta riesgo considerable para la salud en el hombre ni a la naturaleza, luego se deberá iniciar el proceso de remediación de las zonas alteradas, y se deben aplicar criterios para una remediación de los suelos alterados, que están presentes en la normativa citada. A continuación, se puede apreciar que el cuadro 14, contiene la relación de los valores de los Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo según el Ministerio del Ambiente. 31 Cuadro 14. Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo Parámetros en mg/kg Ps Usos del suelo Métodos de Ensayo Suelo Agrícola Suelo Residencial/ Parques Suelo Comercial/ Industrial/ Extractivo ORGÁNICOS Hidrocarburos aromáticos volátiles Benceno 0.03 0.03 0.03 EPA 8260 EPA 8021 Tolueno 0.37 0.37 0.37 EPA 8260 EPA 8021 Etilbenceno 0.082 0.082 0.082 EPA 8260 EPA 8021 Xilenos 11 11 11 EPA 8260 EPA 8021 Hidrocarburos poliaromáticos Naftaleno 0.1 0.6 22 EPA 8260 EPA 8021 EPA 8270 Benzo(a) pireno 0.1 0.7 0.7 EPA 8270 Hidrocarburos de Petróleo Fracción de hidrocarburos F1 (C6-C10) 200 200 500 EPA 8015 Fracción de hidrocarburos F2 (>C10-C28) 1200 1200 5000 EPA 8015 Fracción de hidrocarburos F3 (>C28-C40) 3000 3000 6000 EPA 8015 Compuestos Organoclorados Bifenilos policlorados - PCB 0.5 1.3 33 EPA 8082 EPA 8270 Tetracloroetileno 0.1 0.2 0.5 EPA 8260 Tricloroetileno 0.01 0.01 0.01 EPA 8260 32 Cuadro 14. Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo (continuación…) Parámetros en mg/kg Ps Usos del suelo Métodos de Ensayo Suelo Agrícola Suelo Residencial/ Parques Suelo Comercial/ Industrial/ Extractivo INORGÁNICOS Arsénico 50 50 140 EPA 3050 EPA 3051 Bario total 750 500 2 000 EPA 3050 EPA 3051 Cadmio 1.4 10 22 EPA 3050 EPA 3051 Cromo total ** 400 1 000 EPA 3050 EPA 3051 Cromo VI 0.4 0.4 1.4 EPA 3060/ EPA 7199 o DIN EN 15192 Mercurio 6.6 6.6 24 EPA 7471 EPA 6020 ó 200.8 Plomo 70 140 800 EPA 3050 EPA 3051 Cianuro Libre 0.9 0.9 8 EPA 9013 SEMWW- AWWA-WEF 4500 CN F o ASTM D7237 y/ó ISO 17690:2015 Fuente: MINAM, 2017 33 B) Cadmio Según RODRIGUEZ (2001), y DAS et al., (1998), la presencia del cadmio como mineral existe en representación de sulfuro de cadmio y también se encuentra zinc a la vez. A la vez existe como sustituto en la apatita y la calcita como en ciertos fertilizantes de fosfatos. Según GARCIA (2002), lo más resaltable del cadmio es su alta firmeza al deterioro, su punto de ebullición es bajo y su buena conductividad eléctrica. El cadmio es persistente a la acción de compuestos sintéticos y a temperaturas muy altas. Efecto tóxico del cadmio Según ROHLEDER y KORTE (1982), debido a los procesos físicos como el viento, erosión y procesos biológicos, el cadmio se trasfiere de un lugar a otro y se ve afectado más aún por la mano del hombre alterando el ciclo biogeoquímico del cadmio (Figura 7 y 8). 34 Figura 7. Período biogeoquímico del cadmio (ROHLEDER y KORTE, 1982). Figura 8. Transmisión en el suelo con presencia del cadmio (ROHLEDER y KORTE, 1982). C) Boro El boro se encuentra en rocas ígneas y arenosas generalmente en forma de turmalina, mineral de poco valor para las plantas. El elemento 35 acumulado en suelos de pizarra o arcilla, de origen marino, o de residuos de las plantas, tiene amplia aprovechabilidad (WALLACE, 1943). Los suelos varían ampliamente en la cantidad y distribución del boro utilizable, lo cual puede deberse a condiciones de origen, prácticas de cultivo, medio ambiente, suministro de humus y erosión, principalmente (SCHULTER y STEPHENSON, 1940). El boro aprovechable es generalmente mucho mayor en los primeros 90 cm. del suelo, siendo a menudo la escasez muy pronunciada a profundidad mayor que ésta. Según BERGER y TROUGH (1939), la congregación del boro que se analiza del suelo, no es índice para fertilizar con este elemento, puesto que sólo menos de un 5 % del total está en forma utilizable. La disponibilidad del elemento está asociada con propiedades como el pH y la textura. Quemas sobre el suelo han ocasionado aumento en la cantidad de boro soluble (BAIRD, 1952). En condiciones climáticas de fuertes lluvias y de suelos muy ácidos la cantidad de boro es reducida a niveles bajos por lixiviación. En suelos de poca lluvia se encontró un contenido de boro total de 4 a 88 ppm. (partes por millón), variando su contenido de elemento utilizable entre 0,4 y 64,8 ppm. La cantidad de boro aprovechable está relacionada con la reacción del suelo, así: suelos ácidos tienen alta disponibilidad y suelos alcalinos baja, por esto un sobre 36 encalamiento puede conducir a deficiencia de boro. Regiones áridas muestran alto contenido de este elemento en sus suelos (MILLAR, 1955; ASKEW, 1951). Toxicidad del boro para las plantas El boro es tomado por los vegetales en proporciones mínimas, una cantidad mayor de la indispensable causa toxicidad prácticamente en todas las plantas. La susceptibilidad a exceso de boro varía de acuerdo con la especie de planta y otros factores como, vigor de ella, condiciones ambientales y características del suelo. Para abonar suelos deficientes en boro se puede tomar como máximo unos 56 kg por Ha (MILLAR, 1955). D) Plomo Según la ATSDR, (1999) y UBILLUS (2003), el plomo influencia en las fuentes artificiales y naturales, llegando al final a sufrir cambios gracias a diversos factores que pasa por los factores naturales y artificiales en la biosfera. Los registros de las concentraciones del plomo en la naturaleza, son complicados de obtener gracias a la alteración del ambiente causada por la actividad del hombre y la propia industria. Según BINGÖL y AKÇAY (2005), para la determinación del plomo en el suelo es recomendable usar la técnica de Absorción Atómica en Flama (FAAS). Debido a la fácil manipulación del equipo y su bajo costo de operatividad, pero hay limitada sensibilidad para determinar el plomo, para ello 37 se requiere una separación del analito antes de poder analizar la muestra. E) Cobre Según McKean (1993), es fundamental para la actividad metabólica de las plantas. Es importante para la fotosíntesis de las plantas, como también para la clorofila y la concentración del nitrógeno en las plantas. Una escasa concentración del Cu puede generar el crecimiento reducido como la necrosis de las hojas tiernas jóvenes por una deficiente obtención del hierro y una mínima cantidad en el incremento de las raíces. F) Acidez intercambiable (Al+ e H+) Cuando el valor de saturación con Al+3 en el suelo supera el 60 %, la concentración de este elemento en la solución del suelo es superior a 3 ppm, cantidad que es tóxica para la mayoría de las plantas no tolerantes (EVANS y KAMPRATH, 1970). Se ha demostrado que el Al+3 es el catión asociado a la acidez de los suelos. Los iones H+ liberados en el proceso de mineralización de la MO pueden reaccionar con las estructuras cristalinas de las arcillas liberando aluminio y ácido silícico a la solución del suelo (COLEMAN y THOMAS, 1967). La principal reacción que se presume ocurre cuando suelos o arcillas saturadas de Al son extraídas con soluciones de sales neutras, es el intercambio de Al+3 adsorbido por el catión desplazante (GALLEZ et al., 1976). 38 De otra parte, el Al+3 intercambiable puede estar retenido fuertemente y su extracción por sales neutras es dependiente, en gran medida, de la concentración y naturaleza de la sal añadida. Las titulaciones potenciométricas distinguen el Al intercambiable del no intercambiable como fuente de acidez; mientras que las titulaciones conductométricas no distinguen del todo entre estas dos formas, pero si distingue H+ intercambiable del Al+3 (COLEMAN y THOMAS, 1964). Cuadro 15. Categorización de los suelos de sus cationes Intercambiables Cationes % de rebose de bases y aluminio en la fase de permutación Muy Bajo Bajo Moderadamente Bajo Mediano Moderadamente Alto Alto Muy Alto Potasio* < 1.0 1.1 _ 2 2.1 _ 3 3.1 _ 4 4.1 _ 6 6.1 _ 10 > 10.1 Calcio < 25 26 _ 40 41 _ 60 61 _ 75 76 _ 80 81 _ 85 > 86 Magnesio < 3 4 _ 5 6 _ 10 11 _ 15 16 _ 20 21 _ 30 > 30 Sodio < 1 1 _ 2 2.1 _ 3 3.1 _ 5 5.1 _ 10 10.1 _ 20 > 20 Aluminio 0 0 _ 2 2 _ 5 5 _ 15 15 _ 30 30 _ 60 > 60 Fuente: CASTELLANOS, 2000 G) Capacidad de Intercambio Catiónico Efectiva (ClCe) El CICe es la suma de Cationes Intercambiables de un suelo, conteniendo la Acidez titulable (Al+ + H+). La CICe evalúa solamente los puestos que están ocupados. Generalmente su valor es menor a la CIC (GARRIDO, 2001). 39 Cuadro 16. Niveles de CICE en el suelo. Niveles Valores (meq/100g de suelo) Baja < 1.5 Medio 1.5 – 4.0 Alta > 4.0 Fuente: SCHARGEL y DELGADO, 1990 H) El Magnesio y el Calcio Según MOLINA (1998), en suelos de tendencia acidas se registra poca cantidad de cationes intercambiables, la cual se dispone de poca presencia de los cationes de calcio o magnesio, trayendo consigo como efecto negativo el poco crecimiento adecuado para las siembras. 40 Cuadro 17. Tabla con la interpretación de los análisis de suelos Cationes y Aniones Unidades de medida Clasificación de interpretación de análisis de suelos Bajo Medio Optimo Alto pH < 5.0 5.0 – 6.0 6.0 – 7.0 > 7.0 Ca ppm < 4.0 4.0 - 6.0 6.0 - 15.0 > 15.0 Mg ppm < 1.0 1.0 - 3.0 3.0 – 6.0 > 6.0 K ppm < 0.20 0.2.0 – 0.5.0 0.50 – 0.80 > 0.80 Acidez ppm 0.3 - 1 < 0.30 > 1.0 Sat. Ac. % 10 - 30 < 10.0 > 30.0 P ppm < 12 12 - 20 20.0 - 50.0 > 50.0 Fe ppm < 5 5 - 10 10.0 – 50.0 > 50.0 Cu ppm < 0.5 0.5 - 1 1.0 - 20.0 > 20.0 Zn ppm < 2.0 2 - 3 3.0 - 10.0 > 10.0 Mn ppm < 5 5 - 10 10.0 - 50.0 > 50.0 B ppm < 0.2 0.2 – 0.5 0.50 - 1.0 > 1.0 S ppm < 12 12 - 20 20 – 50 > 50.0 M.O % < 2 2 - 5 5 - 10 > 10.0 Ca/Mg 2 – 5 Ca/K 5 – 25 Mg/K 2.5 – 15 (Ca+Mg)/K 10 - 40 Fuente: MOLINA y MELÉNDEZ, 2002. I) Potasio (K) El potasio se encuentra en el suelo en distintos silicatos que forman parte de las rocas de origen magmático tales como micas, feldespatos, etc. También se combina con la materia orgánica, aunque por su escasa transformación en formas minerales es poco importante. Además, existen formas iónicas libres en la solución del suelo, adsorbidas en el complejo de cambio y fijadas en determinadas arcillas (GARCÍA et al., 2009) 41 Cuadro 18. Rangos del potasio según la textura del suelo Potasio (ppm) Arenoso Franco Arcilloso Muy bajo 0 al 60 0 al 80 0 al 100 Bajo 61 al 120 81 al 160 101 al 200 Medio 121 al 180 161 al 235 201 al 300 Alto 181 al 300 236 al 390 301 al 490 Muy alto Mayores de 300 Mayores de 390 Mayores de 490 Fuente: INIA, 2009 J) Nitrógeno (N) Las concentraciones de nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el suelo, suelen ser limitantes para un incremento y activación de la población microbiana, mientras que otros nutrientes esenciales como el Ca+2, Na+, Fe+2 y 𝑆𝑂4 −2 ya están presentes en cantidades suficientes en el suelo (MENN et al., 2000). La adición de fuentes de N y P inorgánicas, generalmente tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados (CHAINEAU et al., 2003). Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la bibliografía, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. La EPA recomienda utilizar proporciones C:N de 100:10 a 1000:10 para la biodegradación de suelos contaminados por hidrocarburos (U.S. EPA, 1995), y dentro de este intervalo se han descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de 100:10:1 a 300:10:1 respecto al C.O a degradar (DIBBLE y BARTHA, 1979). 42 Cuadro 19. Rangos del nitrógeno total en el suelo CATEGORIA NITRÓGENO TOTAL % Muy bajo < 0.05 Bajo 0.05 - 0.10 Medio 0.10 - 0.15 Alto 0.15 - 0.25 Muy alto > 0.25 Fuente: NOM-021-RECNAT-2000 2.3.3. Propiedades microbiológicas A) Densidad de la población microbiana El suelo normalmente contiene gran número de microorganismos diversos incluyendo bacterias, algas, hongos, protozoos y actinomicetos. Los suelos agrícolas poseen una importante población autóctona de microorganismos, sin embargo, suelen realizarse aplicaciones de microorganismos cultivados o enmiendas orgánicas como estiércol animal, viruta de madera, material vegetal, etc. La incorporación de estiércol sirve para aumentar la población microbiana y proporcionar nutrientes adicionales. Dichos organismos necesitan minerales inorgánicos para poder promover su incremento bacteriano y mantener sus procedimientos de degradación biológica; estos nutrientes pueden estar disponibles en cantidades suficientes en los suelos, pero generalmente se deben agregar como fertilizantes agrícolas para mantener las poblaciones bacterianas. 43 Las bacterias que utilizan el oxígeno para su ATE son aeróbicas; son las necesarias para un compuesto distinto de la suministración del oxígeno, son también células que no necesitan oxígeno; y también hay quienes son de funcionabilidad mixta, también existen los de ATE que son de actividad facultativa. Para biodegradar productos del petróleo solo los microorganismos que son aeróbicos (o facultativos) y heterótrofos son importantes en el proceso de degradación. Con el fin de evaluar la presencia y actividad de una población microbiana autóctono para una biodegradación del petróleo, también deben realizarse estudios en los laboratorios en muestras de suelos, que, como mínimo, deben incluir recuentos en placa de bacterias heterótrofas totales (UFC/gr del suelo). Las densidades de población microbiana de suelos en un rango típico van del orden de 104 a 107 UFC/gr de suelo. Para que el sistema suelo- contaminante-microorganismos sea eficaz el recuento de heterótrofo mínimo deberá ser 103 UFC/gr. Si la densidad poblacional es baja e insuficiente, la población puede incrementarse agregando microorganismos comerciales o cultivados ad hoc (BELTRÁN et al., 2018). 44 Cuadro 20. Relación microbiana y la efectividad biológica Recuento de microorganismos heterótrofos totales y efectividad de un biotratamiento Microorganismos Heterótrofos Totales Efectividad > 1000 UFC/gr suelo seco Generalmente efectivo. < 1000 UFC/gr suelo seco Puede ser efectivo, pero necesita profundizar las pruebas de toxicidad para verificar condiciones tóxicas. Fuente: IRAM 29555-1:2003 2.4. Biorreactores Según CASTILLO et al., (2005), los equipos que son biorreactores de suspensión se usan para una recuperación de un espacio alterado. Los suelos alteraos se inducen en dicho biorreactor con suficiente agua para poder realizar una mezcla cíclica. La cantidad de agua de la mezcla dependerá de la saturación de los agentes contaminadores. Figura 9. Biorreactor en fase líquida (SOLANAS, 2009) 45 2.4.1. Biorreactor de Air Lift Según AGUAYO (2005), la aplicación de un método biológico de tipo Air Lift, trata en una columna en su interior se halla un líquido móvil que se contiene en ella un medio en suspensión y en la fase siguiente de una renuencia de un vapor acuoso. Según LÓPEZ (1998); MIRANDA et al., (2006), los reactores de tipo Air Lift están hechos con una cámara cilíndrica que se contiene ahí el medio de cultivo en un vidrio, también hay un tubo deflector en el centro, con un medio con contenido de NaCl con filtros de aire, el arranque de aire fue impulsada por una bomba de aire de pecera que suministra un caudal de 1,100 mL/min O2. 2.4.2. Componentes que afectan en proceso de operatividad en los biorreactores Air Lift A) Temperatura Según VERGARA et al., (2005), gran parte de los organismos mesófilos, pueden cumplir funciones metabólicas a rangos de temperaturas que van desde los 10 °C a los 35 °C. Según QUIROZ (2003), en temperaturas muy altas se puede generar ciertas renuencias metabólicas de los organismos haciendo que pase rápidamente, generando una disrupción metabólica y se reduce posteriormente, 46 trayendo consigo una mayor eficacia de destrucción de los contaminantes en el biorreactor. B) pH Según MADIGAN et al., (1999), la concentración del pH de los medios se debe ajustar a 7, la cual las bacterias tales como: los Acinetobacter y las Pseudomonas; son neutrófilas y su pH ideal de incremento es 7. Donde las bacterias se reproducen en ese pH, se estabiliza en la sustancia o medio de pH neutro; este proceso ocurre gracias a una permutación de iones entre la sustancia y las células con la finalidad de tener una estabilidad osmótica. Según SIN HA y KUMAR, (2009), el pH de la substancia se alcaliniza con el tiempo luego de 96 horas de incremento bacteriano, el incremento en el pH existe una probabilidad que se vincule con la mutación a un género insoluble de la bacteria o su entorno. C) Disponibilidad de oxígeno (OD) Según BALLERINI et al., (1998), la molécula de oxígeno establece aceptar electrones que se debe administrar en un espacio acuoso de manera que las colonias puedan iniciar su actividad metabólica y perdurar. Según SCRAAG (2002), la molécula de oxígeno es la substancia restrictiva de la aceleración de la reproducción, cuando la siembra esta en incremento poblacional, la dinámica de ingreso de oxígeno (Fi O2) será más a la 47 dinámica de retiro del oxígeno (Ff O2), esto sucede en el uso del oxígeno diluido en una sustancia acuosa por parte de los organismos en incremento y/o segmentación celular. D) Microorganismos Según RATHOR et al., (2003), los organismos perfeccionados en una bio-película, son elementos de mayor operatividad tediosa en el biorreactor Air lift, a la vez estos generan, devastan o transmutan el agente alterador de forma negativa. El consorcio bacteriano necesita condiciones en su contorno, considerando variables como el pH, los nutrientes y la temperatura. E) Biopeliculas microbianas Según STEWART (2003), y MARTINEZ et al., (2006), son la anexión y la encapsulación de organismos del ambiente de una sustancia polimérica extracelular (SPE) en una forma compleja de micro biotopos en el transporte espacial de diversos organismos con asimilaciones sinérgicas e incremento lento, la cual en su limitado organismo se reproduzcan y se estabilicen en circunstancias sintéticas beneficiosas en el aumento de la población selectiva. F) Control de biomasa Según QUIROZ (2003), hay una interrelación entre el control de la biomasa y la efectividad de supresión de los agentes perjudiciales, en 48 consecuencia, es efectivo en el rendimiento del sistema. Esto pasa por la presencia de bio-películas en la superficie y el transporte equitativo en el reactor, la cual es importante para esta operación y certera en un biorreactor Air Lift. 2.5. CALIDAD DEL SUELO Para IDOWU et al., (2008), en el presente esquema conciso de la efectividad (calidad) del suelo, sincronizando las propiedades mecánicas, sintéticas y orgánicas; se puede apreciar en la Figura 10. Figura 10. Integración de las propiedades físicos, químicos y biológicos en la calidad del suelo (IDOWU et al., 2008) Según LAL (1994), la efectividad en los suelos (calidad) es la respuesta a las técnicas la cual hace referencia a las capacidades mecánicas, 49 bióticas y químicas añadidas el proceso climático en su alrededor y a la manipulación de los suelos. A continuación, en la Figura 11, se aprecia dicha relación. Figura 11. Procedimientos y las propiedades en relación a la eficacia y su sustentabilidad en el suelo (LAL, 1994). 50 2.5.1. Erosión de los suelos Según BARROW (1991), la erosión de suelos es un suceso donde uno o más funcionalidades naturales de los suelos son degenerativas. También, se establece que el proceso de la aridificación se aplica para la erosión generada por el hombre como también debido a causas naturales. Características de la degradación de los suelos Según la FAO (1994), y el ISRIC (1995), los tipos de degradación de suelos se describen a continuación: A) Degradación Se observan dos principales formas de la realización de la degradación, la cual se detalla líneas siguientes: Según la FAO (1994), y el ISRIC (1995), la degradación acuática es el transporte de materiales a través del suelo con influencia del agua, donde trae problemas negativos. La substracción de la extensión del suelo, oprime su contenido de producción y en algunos casos se minimiza la fertilidad de los suelos y se cubre usando fertilizantes para su mejoría en la productividad. Según la FAO (1994), y el ISRIC (1995) la degradación eólica es el transporte de materiales del suelo con influencia de los vientos generando una 51 pérdida de la superficie vegetal también por el exceso pastoreo. B) Degeneración química Según la FAO (1994), es el proceso de variación de los micro elementos y macro elementos presentes en la naturaleza. Las cuales se categorizan de la siguiente forma: - Desgaste de fertilización: Se observa en lugares donde no exista fertilización al suelo. - Desgaste en material orgánico: Se observa cuando existe una excesiva presencia de material herbario de plantíos o roces. - Salinidad en los suelos: Se observa por la mala irrigación o aguas con alta concentración de minerales. En zonas donde existe alta precipitación y ocurre una evapotranspiración es cuando el proceso se incrementa de alcalinización. - Suelos ácidos: Ocurre cuando hay una inadecuada fertilización. - Contaminación: Ocurre cuando existe mucha cantidad de plaguicidas como fertilizantes, vertimiento de derivados de petróleo entre otros. C) Degeneración mecánica Según ISRIC (1995), la actividad de compactación debido a la manipulación de las maquinarias, la infiltración y sellado se encuentra en suelos 52 limpios, en consecuencia, son vulnerables estos suelos con deficiente cantidad de materia orgánica. 2.6. Procesos en remediación 2.6.1. Procesos de remediación biológicas Se utiliza una diversidad de procesos que utilizan organismos vivos para biodegradar compuestos orgánicos tóxicos a productos pocos tóxicos. Normalmente se consigue suministrándose aire, minerales, bacterias y/u hongos (bioaumento), también ver el control de temperatura y pH (VAN DEUREN et al., 1997). A) Biotratabilidad Los estudios de tratabilidad permiten descartar que la toxicidad del contaminante o las condiciones del suelo natural impidan la actividad biológica. Las pruebas deben planificarse para que los parámetros evaluados sirvan para diseñar e implementar el sistema constructivo y operativo de la celda de landfarming o de la biopila. Si estos estudios no demuestran aptitud, se necesitarán estudios piloto antes de realizar el tratamiento en gran escala. Estos estudios deben proporcionar datos sobre: - Biodegradabilidad de contaminantes. 53 - Capacidad de los microorganismos indígenas para degradar los contaminantes. - Condiciones de crecimiento óptimo. - Tasas de biodegradación y - Requerimiento de nutrientes naturales y minerales. En el cuadro 21, se reporta análisis físicos y químicos a realizar sobre muestras de suelo del sitio para estudios de biotratabilidad. Cuadro 21. Parámetros físicos y químicos para una biorremediación Parámetros físicos y químicos para estudios de biotratabilidad Parámetro Propiedades que mide Toxicidad del suelo Tipo y concentración del o los contaminantes metales pesados presentes, pH Textura del suelo Granulometría, contenido de arcillas, contenido de humedad, porosidad, permeabilidad, densidad aparente Nutrientes Nitratos, fosfatos, aniones y cationes. Biodegradabilidad del contaminante Concentración de Carbono orgánico total (COT), volatilidad, estructura química. Fuente: IRAM 29555-1:2003 Los resultados analíticos permiten determinar calidad y concentración de contaminantes en los suelos; evaluar la concentración inicial de los contaminantes presentes en las muestras iniciales, para que pueda evaluarse evolución de la concentración; determinar si los macronutrientes 54 (nitrógeno y fósforo) están presentes en concentraciones requeridas para sustentar los niveles incrementales de actividad microbiana y finalmente, evaluar parámetros que pueden promover o inhibir el crecimiento microbiano. La degradación, simulada en un mesocosmo (escala de laboratorio), se mide por la reducción de la concentración de contaminantes y los cambios en la población microbiana y otros parámetros de seguimiento en función del tiempo. Una evaluación del biotratamiento puede incluir los siguientes tipos de estudios: - Control de actividad microbiana: mide la velocidad a la que los microorganismos existentes pueden degradar a los contaminantes en condiciones aerobias sin la adición de nutrientes suplementarios. - Ajuste de nutrientes: permiten calcular la proporción óptima C:N:P para alcanzar velocidades de degradación máximas en ensayos preparados con diferentes concentraciones de nutrientes. - Necesidad de inoculación o bioaumentación: los ensayos se inoculan con consorcios o bacterias biodegradadoras y se analiza para determinar si efectivamente aumentan la tasa de degradación. - Ensayos de control (blancos): permiten medir la velocidad de degradación debido solo a procesos fisicoquímicos del suelo (abióticos). Permiten comparar con los otros ensayos que se basan en los procesos biológicos. 55 Luego de haber comprobado, en escala experimental, que el biotratamiento será potencialmente eficaz, se procede a diseñar el sistema para aplicar. B) Biotransformación Según MCCULLOUGH et al., (1999), los metales pesados en el ecosistema no pueden ser degradados; excepto, con la presencia de bacterias que pueden transformarla y respeta al proceso de oxidación; influyendo en el transporte de los metales pesados en el suelo, en ocasiones se incrementa en el proceso de solubilidad de ciertos productos afectados, beneficiándose así su supresión, como en ocasiones disminuye su transporte de los metales pesados en el suelo. C) Bioestimulación En el proceso de bioestimulación implica la nutrición y/ oxigenación en el suelo alterado, con presencia de bacterias propias del suelo extraído, que se usan para el mejoramiento de los suelos alterados con agentes tóxicos orgánicos para inhibirlo y degradar dichos contaminantes en el lugar contaminado. Este método es aplicado en el tratamiento de suelos inoculados que contienen derivados del hidrocarburo como también ciertos plaguicidas. También presenta ciertas restricciones la cual no es sugerible esta tecnología en suelos arcillosos, altas en estratificación o suelos heterogéneos, debido a las 56 restricciones en el transporte de O2 (ALEXANDER, 1994; VAN DEUREN et al., 1997). 57 III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Zona de realización En la investigación presente, fue realizado en los laboratorios que detallaré a continuación: laboratorio de Análisis de Suelo, agua y Ecotoxicologia; laboratorio de Microbiología General y el laboratorio de Conservación de suelos en la Universidad Nacional Agraria de la Selva, provincia de Leoncio Prado y departamento de Huánuco, cuya muestra del suelo se extrajo de la refinería de petróleo de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. de la ciudad de Pucallpa. 3.1.1. Ubicación política − Región: Huánuco − Provincia: Leoncio Prado − Distrito: Rupa Rupa − Lugar de ejecución: Universidad Nacional Agraria de la Selva − Zona de estudio: Refinería de petróleo de Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. de la ciudad de Pucallpa. 58 Figura 12. Mapa de la zona de estudio 3.2. Factor climatológico y geográficos 3.2.1. Tiempo Según SENAMHI (2010), en la ciudad de Tingo María, se tiene un ambiente caluroso y fresco, que presenta diferencias debido a la diferenciación como el calor y las lluvias. En la ciudad de Tingo Maria, la temperatura promedio puede ser de 20 °C con un mínimo de 18 °C y un máximo de 38 °C, la cual expresan ciclos variables en temperatura. 59 3.2.2. Geología Según SINIA (2016), la ciudad de Tingo María presenta una geología de una Era que es Cenozoica, un Sistema que es Cuaternario, una Serie que es Holoceno, la unidad estratigráfica de depósitos fluviales, con una composición litológica de Depósitos fluviales – Gravas y arenas en matriz limo arenosa, incluye conos aluviales y de simbología (Qh-fl). 3.2.3. Geomorfología Según INGEMMET (2019), la ciudad de Tingo María presenta una geomorfología que se denomina Llanura o planicie aluvial (Pl-al) donde son terrenos ubicados encima del cauce y llanura de inundación fluvial también son considerados terrenos planos, de ancho variable. 3.3. Metodología 3.3.1. Fase recolección de información - Recopilación de información Se procedió a recopilar información de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., sobre incidentes existidos sobre derrames de petróleo refinado, como también se extrajo muestras de suelos luego se llevó a procesarlos y analizarlos en la Universidad Nacional Agraria de la Selva en el Cuadro 22, se aprecia los puntos de muestreos de los suelos extraído de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. 60 Cuadro 22. Coordenada del muestreo del suelo en la refinería Punto geográfico de la muestra de suelo Puntos de referencias ESTE NORTE ALTITUD TANQUE DE ALMACEN (a 5 m de distancia) 551699.97 9072245.91 151 m.s.n.m 3.3.2. Fase de campo A. Toma de muestras para evaluación Se extrajo un monolito de suelo cuya coordenada UTM son: (el primer punto Este: 551699.97, Norte: 9072245.91, Altitud: 151 msnm) cuya área es de 40 x 40 cm con una profundidad de 30 cm y se hizo la extracción representativa por el método del cuarteo por el método B, que consiste en colocar la muestra traída del campo sobre una superficie dura no absorbente, limpia y nivelada; se mezcló totalmente y se formó una pila cónica miniatura, con ayuda de un palustre o cucharón. Se aplanó el cono apretándolo con el palustre. Una vez que se logre un espesor uniforme y una figura regular, se cuarteó el material cortándolo por diámetros normales entre sí que al final se tuvo cuatro porciones iguales, de las cuales se descartaron dos diagonalmente opuestas y se repitió el proceso hasta obtener la muestra del tamaño deseado, de ello se tomó 2 Kg de suelos como muestra final en una bolsa de primer uso, rotulado, y posteriormente fue trasladada a los laboratorios de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, para su respectivo secado al aire libre y análisis de las muestras (AASHTO T248, 2014) 61 Cuadro 23. Flujograma de procesos para el análisis del suelo contaminado 3.3.3. Fase de gabinete Se realizó mapas temáticos de la zona de estudio con el uso del Google Earth (2019) y ArcMap (10.3), el análisis estadístico e interpretación de los datos recopilados de la se realizó a través de los programas en Microsoft Excel (2016) y SPSS 23, las cuales se realizó los mapas temáticos y los análisis estadísticos. 3.4. Unidad experimental - Bacterias autóctonas del suelo con capacidad remediadora. - Suelo contaminado con petróleo para aislar los microorganismos. REFINERIA DE LA EMPRESA MAPLE GAS CORPORATION DEL PERÚ S.R.L EXTRACCION DEL SUELO (1 MONOLITO) EN LA REFINERIA DE LA EMPRESA MAPLE GAS CORPORATION DEL PERU S.R.L, DONDE SE EXTRAJO DEL AREA PUNTUAL DEL SUELO, LUEGO SE USÓ EL METODO DE CUARTEO PARA LA OBTENCION DE LAS MUESTRAS REPRESENTATIVA DEL MONOLITO. ANÁLISIS DE LA MUESTRA DEL SUELO EN LOS LABORATORIOS DE MICROBIOLOGIA, LABORATORIO DE ANÁLISIS DE SUELO, AGUA Y ECOTOXICOLOGIA Y DE CONSERVACIÓN DE SUELOS DE LA UNAS. PROCESAMIENTO Y OBTENCIÓN DE RESULTADOS 62 3.5. Determinación de las propiedades físicas, químicas y biológicas 3.5.1. Determinación de las propiedades físicas del suelo A. Determinación de la permeabilidad Se aplicó el método de la permeabilidad variable, donde el equipo fue instalado previamente por el responsable del laboratorio de Conservación de suelos, así como la preparación del suelo. Se colocó la columna de entrada de agua y se dejó que fluya hasta que culmine el agua filtrada por la columna hasta saturar el suelo y luego tomar mediciones posteriores. Después de este tiempo, se determinó el tiempo de transcurso del flujo del agua a través del permeámetro (DAS, 2019). B. Determinación de la conductividad Hidráulica Se determinó la conductividad hidráulica, usando el método del Permeámetro de carga constante la cual es un método a nivel de matriz de suelo. El método se utilizó para la muestra inalterada y después de la saturación se proveo una alimentación de agua a una carga constante, con lo que el agua se mueve a través de la muestra hasta alcanzar un régimen de equilibrio en base a la medida del caudal de salida desde el permeámetro, así como la diferencia de carga entre la superficie del nivel constante y el nivel de agua en la salida (COELLO, 2005). Resolviendo la ecuación de Darcy al término de conductividad, se obtiene la siguiente ecuación: 63 Ks = Q T x A x 1 L+d Ks: Conductividad hidráulica saturada (cm/h) Q: Volumen de flujo de agua a través de la sección A (cm3) T: Tiempo (h) L: Altura de la muestra de suelo (cm) d: Altura de agua (cm) C. Determinación del color del suelo La determinación del color del suelo, se realizó con los diferentes patrones de color establecidos en la tabla Munsell. La tabla Munsell es un sistema de notación de color basado en una serie de parámetros que permitió identificar el color del suelo ya que varían en función del matiz, brillo y croma (MUNSELL, 1994). D. Determinación de moteados en el suelo Se determinó los moteados por las manchas de diferentes colores o sombras del color intercalado con el color dominante del suelo, la cual indican que el suelo estuvo sujeto a condiciones de alternancia entre mojado (reducción) y/o secado (oxidación). El moteado de la matriz del suelo se describió en términos de abundancia, tamaño, contraste, límite y color (SENA, 2013). E. Determinación de la consistencia del suelo La prueba se realizó cuando en un suelo saturado y seco, donde primero se determinó la adhesividad, que es la cualidad que tienen los materiales 64 del suelo de adherirse a otros objetos, después se determinó la plasticidad, que es la cualidad por la cual el material edáfico cambia continuamente de forma, pero no de volumen, bajo la acción de una presión constante, y se mantuvo dicha forma al desaparecer la presión (FAO, 2019). 3.5.2. Determinación de las propiedades químicas del suelo A. Determinación del Cobre Se analizó el contenido de cobre utilizando el método de Mehlich donde, se pesó 5 gr del suelo y se agregó 20 mL de (H2COOH 0.2 mol/L + NH4NO3 0.25 mol/L + NH4F 0,015 mol/L + HNO3 0,015 mol/L + EDTA 0,001 mol/L a pH 2.5), seguidamente se agitó por 5 minutos y posteriormente se filtró por gravedad usando papel filtro Whatman N° 42, y finalmente se realizó las lecturas y así obtener las concentraciones de cobre con el espectrómetro de absorción atómica (BENT JONES, 1991; MEHLICH, 1984). B. Determinación del Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) Se determinó del contenido total de metales traza de Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) por el método EDTA a un 0.05M de pH 7, donde se pesó 200 mg del suelo, las cuales se digirieron por microondas luego de agregó 1.5 mL de HNO3 al 65 %, y 4.5 mL HCl al 37 %, luego las muestras digeridas se trasladaron a matraces de 10 mL con agua destilada que luego fueron filtradas. Finalmente se analizó por Espectrometría de Absorción Atómica con llama (AAS), las curvas de calibración de cada elemento y se prepararon diluciones de un multiestandar de 1000 ± 10 mg/L, en HNO3 al 1M. Este método se basa en la suposición que 65 los iones asociados a algunos componentes del suelo pueden ser desplazados de los puntos de adsorción por la presencia de iones competitivos en la solución extractante (KENNEDY et al., 1997). C. Determinación del petróleo Se pesó 5 gr de suelos en la balanza analítica y se puso los suelos dentro de los papeles filtros N° 41, seguido se puso dentro del Dedal del Soxhlet para su lavado de los aceites y grasas, luego se utilizó como solvente orgánico el éter de petróleo, la cual en cada matraz de bola se le añadió 150 mL de combustible señalado, después se procedió a prender cada horno de la manta de calentamiento del dispositivo del Soxhlet, a la vez se abrió la llave del agua para ser trasladado al flujo de agua con el fin de poder estabilizar la temperatura del dispositivo de Soxhlet, seguido se esperó la operatividad del dispositivo de Soxhlet por un tiempo de 8 horas, después del tiempo se dejó de operar el dispositivo, seguido se sometió a una estufa a 120 °C durante 4 horas los matraces de bola que contenían los solventes orgánicos, luego se tomó los pesos de las muestras de suelos con el papel filtro y los matraces de bola que contenían los solventes orgánicos, seguido se procedió a determinar la concentración del petróleo refinado por el método gravimétrico (US EPA 821- B94-004, 1995; EPA 3540C ,1996). Cálculos La diferencia en peso corresponde al contenido total de HTPs. Para hacer el cálculo de concentración de petróleo refinado provenientes de la 66 muestra, se debe considerar la cantidad de suelo que se pesó para la extracción, así como la humedad de la muestra. El resultado debe expresarse en mg de HTP/kg de suelo seco, y se calcula de la siguiente manera: HTPs (mg/kg de s.s.) = (RB – RA) * (FC) / (P * FH). Donde: HTPs (mg/kg de s.s.) = Hidrocarburos totales del petróleo en mg/kg de suelo seco. RA= peso (mg) del recipiente vacío a peso constante. RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgánico concentrado. P = cantidad de suelo extraído (g). FH = factor de corrección de humedad (1-(% humedad/100)). FC = factor de corrección para transformar a kg de s.s. = 1 000. D. Determinación del Boro Se pesó 10 g de suelo en tubos de plásticos de 50mL con tapa rosca, seguido se añadió 20 mL de agua destilada y se tapó el tubo y se agito vigorosamente, luego se colocó el tubo en baño maria a 100 °C durante 15 minutos, seguido se filtró la suspensión por succión en frascos de plásticos, luego de ese extracto se extrajo 2 mL de ello, luego se añadió 4 mL de la solución buffer y 2 mL del reactivo de color, se agitó vigorosamente y se dejó 45 minutos, seguido se calibró el espectrofotómetro con el que se leyó la concentración o absorbancia con los patrones (0 ppm, 0.2 ppm, 0.4 ppm, 0.6 ppm, 0.8 ppm y 1 67 ppm) usando una longitud de onda de 430 nm, luego se realizó las lecturas y se calculó la concentración de boro en el suelo (BERGER y TRUOG, 1939). G) Determinación de la Acidez intercambiable (Al+ e H+) Se transfirió 50 mL del extracto obtenido con KCI 1 M a un Erlenmeyer de 125 mL y se agregó 3 gotas de fenolftaleína y se tituló con Na(OH) 0.05 M hasta la aparición de un color rosado pálido permanente, se anotó los mL de Na(OH) gastados en la titulación. Después de la titulación, se agregó una gota de HCI 0.01 M para que el color rosado desaparezca y se agregó 10 mL de NaF 1 M y se tituló con HCI 0.05 M hasta que el color desaparezca otra vez por más de un minuto, y determinó las concentraciones en el espectrofotómetro de absorción atómica la concentración de los Al+ e H+ y se operó en los siguientes cálculos (COLERNAN et al., 1959; YUAN, 1959). Cálculos La acidez y el aluminio Intercambiable se expresan en meq de suelo: Acidez Intercambiable = mL Na(OH) * N Na(OH) * vol extracto/vol alícuota * 100/peso de la muestra. = mL Na(OH) * 0.05 * 100/50 * 100/10 = mL Na(OH) * 1 = meq de suelo. Aluminio Intercambiable = ml HCl * N HCI * vol extracto/vol alicuota de la muestra. = mL HCI * 0.05 * 100/50 * 100/10. = mL HCI * 1 = meq de suelo 68 H) Determinación de la Capacidad de Intercambio Catiónico Efectiva (ClCe) Se determinó el CICe tomando como la suma de los cationes en el extracto determinado las cuales se expresan en meq de suelo, usando los resultados obtenidos de los métodos realizados (MCKEAN, 1993). CICe = Ca + Mg + K + Al I) Determinación del Calcio y Magnesio Se pesó 10 g de suelo, se añadió 50 mL de KCI 1 M y se agitó durante 5 minutos, posteriormente se filtró la mezcla de este extracto se determinará en el espectrofotómetro de absorción atómica la concentración de Ca y Mg (MCKEAN, 1993). 3.5.3. Determinación de las propiedades biológicas del suelo A. Determinación de la biomasa bacteriana presente en los suelos contaminados con petróleo refinado Preparación de medios Para el recuento de bacterias se utilizó los siguientes medios: - Caldo Peptona: Se preparó 100 mL de agua destilada con 0.1 g del agar peptona. 69 - Agar Plate Count: Se preparó 200 mL de agua destilada con 4.5 g del agar Plate Count. - Agar Actinomyces: Se preparó 200 mL de agua destilada con 4.4 g del agar Actinomyces. - Agar Sabouraud: Se preparó 200 mL de agua destilada con 13 g del agar Sabouraud. Los matraces que contienen los medios de cultivos se agitaron y se llevaron al baño maria para una disolución total, luego se llevaron a esterilizar al autoclave a 15 psi de presión, se dejó enfriar hasta 45 ºC para servir en placas. Para el recuento de microorganismos se realizó, el método de recuento en placa, para ello se preparó dos matraces conteniendo en cada uno 90 mL de caldo peptona al 1 %, seguido se pesó 10 g de suelo y se diluirá en los 90 mL de caldos peptonas y se agitó, luego se filtró después, y se retiró 10mL de los caldos peptonas con una pipeta a los 3 tubos de ensayos respectivamente, donde se aplicó el método de diluciones seriadas , las cuales son (10-1, 10-2, 10-3) seguido se adicionó a su respectivo matraz con caldo peptona donde se homogenizó el caldo peptona, seguido se aplicó el método de placa vertida , para el cual se retiró 1 mL de la última dilución (10-3), y se vertió en una placa petri vacía y se esterilizó seguido se agregó 10mL de agar Plate Count, más un 1 g del agar Manitol Salado, Agar Sabouraud y el agar Actinomyces y se dejó solidificar por unos 5 minutos, seguido se llevó las placas a la estufa a 37 ºC por 48 horas (Véase Figura 13). Después de este tiempo se pudo realizar el conteo de microorganismos utilizando el contador de colonias manual. 70 La fórmula para el conteo de microorganismos (M.O) es la siguiente: M.O = Nº colonias × Inóculo de siembra × Factor de dilución Figura 13. Cálculo del número de microorganismos por el método de diluciones seriadas (TÓRTORA, 2007). 3.5.4. Aislamiento de bacterias del suelo contaminado con petróleo El aislamiento de los microorganismos del mismo suelo nos permitió tener la población microbiana presente en este para su posterior selección (ALTAMIRANO y POZZO, 2000). Procedimiento: - Se pesó 10 g de suelo en la balanza digital. - Seguido se le añadió a un matraz con agua destilada y Caldo Peptona al 0.1 % (a 100 mL del total del matraz). 71 - De esta muestra se filtró, y del filtrado se vertió 1 mL de la muestra y se le añadió al primer diluyente (10-1) que contiene 9 mL de agua destilada con caldo peptona al 0.1 %. - De esta dilución se vertió 1 mL para agregar a otro diluyente y se volvió a repetir esta acción dos veces más (10-1, 10-2 y 10-3). - Del último diluyente se extrajo una alícuota de 0.25 mL en cual se vertió en una placa Petri con los medios agares que son: M77, CLED, MCCONKEY y MANITOL SALADO, seguido se incubó de 24-48h entre 37 °C y temperatura ambiente. 3.5.5. Identificación de géneros microbianos en suelos contaminados con petróleo refinado A. Preparación de medios de cultivo Los medios necesarios para el crecimiento de bacterias son los siguientes y se prepararon de esta manera: - Agar CLED: Se preparó 200 mL de agua destilada con 6.6 g del agar Cled. - Agar McConkey: Se preparó 200 mL de agua destilada con 10.3 g del agar McConkey. - Agar M77: Se preparó 200 mL de agua destilada con 6.8 g del agar M77. - Agar Manitol salado: Se preparó 200 mL de agua destilada con 22.22 g del agar Manitol salado. 72 Todos los matraces se mezclaron bien y se llevó al baño maría para que hiervan hasta la disolución total, luego se llevó a esterilizar al autoclave a 15 psi de presión por 15 minutos, y se dejó enfriar hasta 45 ºC para servir a las placas petris. Se pesó 10 g del suelo, se adicionó en el caldo peptona al 0.1 % luego se filtró y se sacó 10 mL para las diluciones 10-1, 10-2,10-3, de la última dilución (10-3), y se sembró en el agar M77, Agar Manitol salado, Agar Cled, Agar Macconkey y Agar Cetrimide, y se incubó a una temperatura de 37 °C y el agar M77, se incubó a una temperatura ambiente por 24-48 horas (LOPEZ, 1990). B. Coloración bacteriana Se tomó una pequeña muestra de la cepa y se diluyó en el portaobjetos. Posteriormente se fijó la muestra al calor flameándola en el mechero, cuidando no quemar la muestra (LOPEZ, 1990). - Se puso los portaobjetos sobre un soporte, se vertió a la muestra con cristal violeta y se esperó a que transcurra 1 minuto, seguido se escurrió y se enjuagó las muestras de los portaobjetos. - Luego se dispersó a la muestra con solución de lugol y se esperó a que transcurra 1 minuto y se escurrió y se enjuagó las muestras. - Seguido se dispersó a la muestra alcohol acetona y se esperó que transcurran 5 segundos y se escurrió y se enjuagó en movimiento de vaivén. 73 - Luego se vertió a la muestra con safranina, y se esperó que transcurra 1 minuto, se escurrió y se enjuagó las muestras. - Se dejó secar las muestras y se agregó una gota de aceite de inmersión y seguido se observó en el microscopio a 100x. C. Prueba de Diferenciación Bioquímica De todas las colonias que se aisló en el medio M77, Cled, MacConkey, Cetrimide, Muller Hinton y Manitol Salado; se cogió una sola colonia con el ansa de siembra, se sembró en todos con medios de cultivo diferenciales, y se dejó incubar a 37 °C por 48 horas (LOPEZ, 1990). Después se incubó las placas Petri para el crecimiento de bacterias, se realizaron las pruebas bioquímicas siguientes: Indol: Se vertió aproximadamente 9 mL de caldo peptona al 0.1 % a un tubo de ensayo, se realizó la siembra de bacterias con el aza de siembra por el método de enjuague. Se incubó por 48 horas, para la determinación se usó el reactivo de KOVAC, y se vertió de 2 – 3 gotas. Rojo de metilo: Se utilizó el caldo rojo de metilo y voges-proskauer (RM-VP), aproximadamente 9 mL en cada tubo de ensayo, se sembró mediante el método de enjuague; se incubó por 48 horas y como reactivo se adicionó el rojo de metilo de 2 - 3 gotas. 74 Voges-Proskauer (VP): Se vertió en el tubo de ensayo el caldo RMVP, se sembró mediante el método de enjuague y se incubó por 48 horas; como reactivo se utilizó hidróxido de sodio Na(OH) al 4 % de 2 - 3 gotas y se adicionó el reactivo de alfa naftol de 2 – 3 gotas. TSI: Se vertió el agar a 45 ºC hasta la tercera parte de los tubos de ensayo, se dejó enfriar en pico de flauta, luego se sembró con puntura y estrías, se incubó a 37 ºC por 48 horas; el tipo de reacción positivo o negativo se conoce por el cambio de color. LIA: Se vertió el agar a los tubos de ensayo a una temperatura de 45 ºC y se dejó enfriar en pico de flauta, y se procedió a sembrar la colonia de bacteria seleccionada mediante el método de puntura y estrías; la reacción se muestra mediante el cambio de color. Citrato de Simmons: Se vertió el agar en los tubos de ensayo y se dejó enfriar en modo inclinado para luego sembrar por el método de estrías. Pasada las 48 horas de incubación, el cambio a color azul indicó la reacción positiva o negativa. SIM: Se vertió el agar en los tubos de ensayo y se dejó enfriar para luego sembrarlo por el método de Puntúa. Pasada las 48 horas de incubación, para la determinación se usó el reactivo de K(OH) (4 %), y se vertió de 2 – 3 gotas. 75 Caldo Malonato: Se vertió el caldo en los tubos de ensayo y se realizó la siembra por el método de enjuague, después se incubó por 48 horas se observó si hubo o no reacción, es positivo si cambia a color azul. Úrea: Se vertió el agar en tubos de ensayo, y se sembró la colonia de bacterias por el método de puntura, al cabo de las 48 horas el cambio de color expresó si hubo reacción positiva. Y se leyó los resultados, y agregó los reactivos de confirmación a los tubos que corresponda y se observó el cambio de color. Prueba de indol: Se agregó 3 o más gotas del reactivo de KOVAC al tubo con caldo peptona. Si da un anillo rojo es positivo a indol (metabolitos proteicos), anillo anaranjado es negativo el indol. Prueba de rojo de metilo (RM): Se agregó 2 a 3 gotas de colorante rojo de metilo a uno de los tubos con caldo MR-VP, la cual expresa el color rojo si es positivo a rojo de metilo, si da color anaranjado es negativo a rojo de metilo. Prueba de voges-proskauer (VP): Al otro tubo con caldo MR-VP se agregó 2 a 3 gotas de K(OH) al 4 % luego se añadió gotas de reactivo alfa naftol se esperó entre 10 a 20 minutos. Una coloración rosada nos indica que es positivo el VP, y si la coloración es amarilla nos indica que es negativo el VP. 76 Luego para las otras pruebas de citrato TSI, LIA, Urea, se observó el viraje de color de cada prueba, y se observó con una tabla de pruebas bioquímicas la especie o genero de cada microorganismo. Prueba TSI: Degradación de los tres azucares (Lactosa, Glucosa y Sacarosa). K= Alcalino A= Acido K/A: La bacteria ha degradado sacarosa y glucosa. A/A: La bacteria ha consumido los tres azucare + H2S + gas. A/K: bacterias anaerobias. R/K: No hay reacción. Prueba de LIA (Lisina descarboxilasa): Se observó la desaminación descarboxilación. K= Alcalino A= Acido K/K: No reacción. K/A: Diseminación de lisina. A/K: Diseminación de lisina. A/A: Diseminación de lisina +H2S+gas. Prueba de Citrato de Simón: Cuando la bacteria utilice como fuente de carbono al citrato el medio se alcaliniza y sube su pH a 6.8 – 7.4 y da un color azul (positivo) y verde (negativo). 77 Prueba caldo Malonato: Cuando la bacteria utilice como una única fuente de carbono el malonato de sodio este medio se alcaliniza sobre su pH a 6.8 – 7.4 y da un color azul (positivo) y verde (negativo). Prueba de Urea: Cuando la bacteria utilice como una única fuente de carbono la ureasa este medio se alcaliniza sobre su pH a 6.8 – 6.9 fucsia con un pH 7.8 (positivo) y si da un color rosado pálido (negativo). Prueba SIM: Se adicionó 2 - 3 gotas de reactivo K(OH) 4 %, si la bacteria utiliza como fuente de carbono da un anillo color rojo indol (positivo) y si no reacciona (negativo). 3.5.6. Selección de microorganismos degradadores del petróleo refinado La selección de los microorganismos degradadores de hidrocarburos nos permitirá identificas a aquellos microorganismos que son capaces de degradar el hidrocarburo y serán utilizados en esta investigación (ALTAMIRANO y POZZO, 2000). Procedimiento: - Los microorganismos que se desarrollaron en el medio BHI (caldo cerebro corazón) se los repicará en caldos peptona 1 %, - Después se incubaron por 48 horas a temperatura ambiente. 78 - Luego se sembraron sobre medio Mínimo de Sales Minerales (MMSM) conteniendo el suelo contaminado con petróleo refinado en varias concentraciones (0.25 %, 0.50 %, 0.75 %, 1.00 %); estos se incubarán a temperatura ambiente por 48 horas. - Los microrganismos desarrollados serán los que se acondicionaron a los tratamientos de degradación del petróleo refinado en el suelo muestreado. - Luego se mantuvieron en cepas individualmente en el Agar Muller Hinton hasta su uso. 3.5.7. Selección/elección de organismos para uso biotecnológico A. Fase de selección - Se extrajo una muestra de suelos a analizar. - Se pesó 10 g del suelo extraído - Se preparó 100 mL de Caldo peptona al 0.1 %, y se dejó reposar por 20 a 30 minutos y se añadió 10 g del suelo extraído. - Se filtró la mezcla del caldo peptona al 0.1 % con los 10 g del suelo extraído, en un matraz. - Seguido se extrajo 10mL del medio filtrado y se le añadió al 90mL del BHI (101) y se dejó incubar por 24 horas entre 20 a 37 °C. - Luego de las 24 horas de ser incubado, se extrajo 1 mL del matraz incubado y se vertió en un tubo de ensayo con 8 mL de caldo peptona al 0.1% (101). 79 - Se extrajo 1 mL del tubo de ensayo con 8 mL del caldo peptona y la incubación y se repitió el mismo procedimiento hasta el 102 y 103. - Plaquear con agares M77, MacConkey, Cled, Muller Hinton y Manitol Salado, para cada muestra del suelo. - De la última solución (103), se sembró en las placas que contienen los agares M77, MacConkey, Cled, Muller Hinton y Manitol Salado y se dejó incubar por 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C. - Luego de 24 o 48 horas de incubación de los agares, se pasó a sembrar en un matraz con caldo BHI, todas las colonias de microorganismos encontradas en dichas placas. - Luego se extrajo 10 mL del BHI incubado con los microorganismos y se le vertió en 190 mL del agar Muller Hinton, seguido se llevó las muestras a incubar por 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C, para su fase de elección (LÓPEZ, 2006). B. Fase de elección - Realizado la fase de selección, se preparó el medio mínimo de sales de Davis (MMS) en un matraz de 1L. - Seguido se dividió en 4 matraces, 200mL del medio mínimo de sales de Davis (MMS) en cada matraz. - Se añadió 4 concentraciones diferentes del petróleo refinado a cada matraz con 200mL del medio mínimo de sales de Davis (MMS), dichas concentraciones son las siguientes: 0.25 % (0.50 mL), 0.50 % (1.0 mL), 0.75 % (1.50 mL) y 1.00 % (2.00 mL), 80 respecto de cada matraz con el medio mínimo de sales de Davis (MMS). - Seguido se plaqueó y se realizó 3 repeticiones por cada concentración del petróleo refinado y se sembró en cada placa con diferente concentración del hidrocarburo (petróleo refinado) y se dejó incubarlo por 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C en placas invertidas. - Luego de la incubación de 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C, se presenció el crecimiento de los microorganismos resistentes a dichas concentraciones del hidrocarburo (petróleo refinado). - Se seleccionó los microorganismos que crecieron en mayor concentración del hidrocarburo (petróleo refinado) para luego replicarlos en el agar Muller Hinton y se incubó en tubos de ensayos por 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C. - Luego se incubó por 24 o 48 horas entre 20 a 37 °C, se conservó en refrigeración (4 °C a 8 °C), hasta su utilización (LÓPEZ, 2006). 3.6. Preparación de biorreactores air lift Los biorreactores tipo air lift que se utilizaron para este trabajo fueron preparados en el laboratorio, constituidos por una cámara de cultivo cilíndrica de vidrio de 100 mm de diámetro de 200 mm de altura, tubo deflector o de distribución central de 80 por 28 mm y frascos con solución saturada de NaCI como filtros para aire, la fuente de aeración fue una bomba de aire doble 81 salida (ELITE 802) la que proporcionó 1,100 mL/min O2 (LÓPEZ, 1998; MIRANDA et al., 2006). La cámara de cultivo y tubo deflector o de distribución de los biorreactores se esterilizaron al vapor de agua, utilizando la autoclave a 121 °C a 151 bs/pulg2 por 15 minutos; y se esterilizaron por sumersión en solución alcohol-ácida al 1 % (etanol - HCI) los accesorios del biorreactor como son la cubierta superior (material micro poroso), válvulas de control de entrada/salida de aire y conectores de flujo de aire (LÓPEZ, 1998; MIRANDA et al., 2006). Figura 14. Instalación del biorreactor Air Lift 3.6.1. Operación en los biorreactores Las bacterias seleccionadas y refrigeradas, fueron reactivadas en nuevos medios de BHI constituyéndose en inóculos para los biorreactores tipo 82 Air Lift en una proporción de 8 % u 80 mL del BHI respecto al volumen total de los biorreactores (1000 mL), añadido a cada biorreactor 1 mL de glucosa, con una variabilidad de volúmenes de las dosis del petróleo a concentraciones de 0.25 %, 0.50 %, 0.75 % y 1.00 %; y diferentes volúmenes del Medio Mínimo de Sales Minerales de Davis (MMSD). La operación en batch se inició al poner en funcionamiento las bombas aireadoras con un tiempo de operación de 15 días, cuyas mediciones de los parámetros medidos en los biorreactores son: Temperatura, Oxígeno Disuelto, pH y densidad microbiana; donde las mediciones de dichos parámetros fueron en los días 1er, 8vo y 15vo día (SCRAAG, 2002). 3.7. Diseño de investigación A. Diseño Esta investigación es de un diseño experimental, debido a que se manipuló la variable independiente (Petróleo refinado) para observar la variable dependiente (Microorganismos). B. Población y muestra Unidad de análisis La unidad de análisis es el suelo de una refinería contaminado con petróleo refinado. 83 Población La población son todos los microorganismos del suelo contaminado con petróleo refinado (Microorganismos viables, actinomicetos y hongos). Muestra La muestra que se usó muestras de 10 g del suelo contaminado con petróleo haciéndose 3 repeticiones, donde fueron sometidas a un análisis en los laboratorios seguido a una biorremediación con los microorganismos encontrados. Figura 15. Diseño experimental 84 C. Variables Cuadro 24. Variables y operación VARIABLE DEFINICION CONCEPTUAL DEFINICION OPERACIONAL DIMENSIÓN INDICADORES ESCALA D e p e n d e n c ia Microorganismos biorremediadores Los microorganismos, que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, poseen la capacidad de utilizar diferentes compuestos tóxicos como fuente de carbono, sin embargo, su densidad poblacional es limitada en sitios no contaminados y se incrementa en ambientes impactados por un contaminante (NÚÑEZ, 2003; MADIGAN et al., 2004). Se realizará análisis biológicos como la densidad microbiana y la selección de microorganismos con capacidad degradativa del petróleo. Concentración Eficiencia Biomasa g/mL In d e p e n d e n c ia Petróleo refinado Se define como una mezcla heterogénea de compuestos orgánicos, principalmente hidrocarburos insolubles en agua y su fórmula general es Cn𝐻2𝑛+2 (OKOH, 2006; CANDO, 2011). También contiene elementos que constituyen menos del 3 % (v/v) como el nitrógeno, azufre y oxígeno, y menos del 1 % (v/v) de elementos traza fósforo y metales pesados vanadio y níquel (OKOH, 2006). Se realizará el análisis del petróleo refinado por el método de gravimetría a la muestra del suelo contaminado con petróleo refinado. Concentración Aceites y grasas mL/g de suelo 85 3.7.1. Ajuste estadístico Para los análisis de los datos se determinó si la concentración de petróleo y la concentración de microorganismos, se realizó la distribución normal (DN) y homogeneidad de varianzas, luego se realizó el análisis de varianza (ANVA) y la prueba Tukey para determinar diferencias significativas de la degradación del petróleo refinado en relación de los microorganismos entre medias de tratamientos, para nivel de significación de 5 %, las cuales son: Microorganismos (testigo), Microorganismos + 0.25 % petróleo refinado, Microorganismos 0.50 % petróleo refinado, Microorganismos 0.75 % petróleo refinado y Microorganismos 1.00 % petróleo refinado (Véase Anexo A) 86 IV. RESULTADOS 4.1. Determinación de las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo 4.1.1. Determinación de las propiedades físicas en el suelo En el cuadro 25, se observan las propiedades físicas del suelo en estudio cuyos resultados de los análisis están detallados. Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo Muestra Análisis Mecánico Permeabilidad (cm/Hora) Conductividad Hidráulica (cm/Hora) Arena (%) Arcilla (%) Limo (%) Textura Muestra 1 26 45 29 Arcilloso 0.89 0.51 87 Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo (continuación…) Color Gradiente Munsell Código de color del suelo Munsell Descripción del color del suelo Munsell Horizonte Profundidad Comentario 12.5 2.5YR 4/8 Rojo Ag 0 - 5 cm “g” moteado (abigarrado) por oxidación/reducción del Fe. Manchas de colores pardos/rojos y gris/verde. Hidromorfia parcial. Bg , Cg y más raramente Ag . Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo (continuación…) Moteados Clasificación de la abundancia de moteados Clasificación del contraste de los moteados Código Abundancia de moteados % Código Clasificación del contraste de los moteados Descripción A Abundante > 40 D Distinto Aunque no tan impresionante, los moteados son bien vistos. El matiz, croma y valor de la matriz son fácilmente distinguible de los moteados. Pueden variar por más de 2.5 unidades de matiz o muchas unidades en croma o valor. 88 Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo (continuación…) Moteados Clasificación del tamaño de los moteados Clasificación del límite entre el moteado y la matriz Código Clasificación del tamaño de los moteados mm Código Clasificación del límite entre el moteado y la matriz mm V Muy Fino < 2 C Claro 0.5 - 2 Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo (continuación…) Consistencia Consistencia en seco Consistencia en húmedo Códigos Consistencia del suelo en seco Descripción Códigos Consistencia de la masa del suelo húmedo Descripción VHA Muy duro Muy resistente a la presión; puede disgregarse en las manos solo con dificultad. VFR Muy friable El material de suelo se aplasta bajo presión leve, pero es coherente cuando se lo presiona todo al mismo tiempo. 89 Cuadro 25. Propiedades físicas del suelo (continuación…) Consistencia en seco Códigos Clasificación de la plasticidad del suelo Descripción SPL Ligeramente Suave Se forma el cordón pero se rompe inmediatamente si se le curva en forma de aro, la masa del suelo se deforma por una muy ligera fuerza. 4.1.2. Determinación de las propiedades químicas en el suelo En el cuadro 26, se observan las propiedades químicas del suelo en estudio con los siguientes análisis realizados en la muestra del suelo sin contaminar. A. Propiedades químicas del suelo sin contaminar Cuadro 26. Propiedades químicas del suelo sin contaminar Muestra pH M.O N P K Ca Mg 1:1 % % ppm ppm Cmol(+)/kg Cmol(+)/kg Muestra 1 4.90 1.14 0.06 5.12 85.96 2.94 2.91 90 Cuadro 26. Propiedades químicas del suelo sin contaminar (continuación…) Muestra Al H+ CICe (Cmol(+)/kg) % % % HTP (Cmol(+)/kg) (Cmol(+)/kg) Base Camb. Ac. Camb. Sat. Camb. mg/ kg Muestra 1 11.86 3.95 21.66 27.00 73.00 54.76 1180 B. Propiedades químicas del suelo contaminado En el cuadro 27, se observan las propiedades químicas del suelo en estudio con los siguientes análisis realizados en la muestra del suelo contaminado. Cuadro 27. Propiedades químicas del suelo contaminado Muestra pH M.O N P K Ca Mg 1:1 % % ppm ppm Cmol(+)/kg Cmol(+)/kg Muestra 1 3.92 1.66 0.08 2.55 32.34 3.95 0.68 Cuadro 27. Propiedades químicas del suelo contaminado (continuación…) Muestra Al H+ CICe (Cmol(+)/kg) % % % (Cmol(+)/kg) (Cmol(+)/kg) Base Camb. Ac. Camb. Sat. Camb. Muestra 1 10.2 0.5 15.33 30.18 69.82 66.56 91 Cuadro 27. Propiedades químicas del suelo contaminado (continuación…) Muestra Cd Pb Cu B Mn Fe HTP Zn ppm ppm ppm ppm ppm ppm mg/ kg ppm Muestra 1 0.48 2.4 1.28 2.22 5.70 115.64 1254 2.78 4.1.3. Determinación de las propiedades biológicas en el suelo A. Concentración bacteriana presente en el suelo En el cuadro 28, se observa la concentración celular de microorganismos en bacteria en la primera y segundo muestra y se promedió para la obtención de un único resultado en las tres repeticiones que se obtuvo. Cuadro 28. Concentración de microorganismos en bacterias en el suelo. Zona de muestreo Nº de microorganismos 1º muestra Refinería Maple Gas Corporation del Perú (1ra repetición) 531 x 103 UFC Refinería Maple Gas Corporation del Perú (2da repetición) 946 x 103 UFC Refinería Maple Gas Corporation del Perú (3ra repetición) 698 x 103 UFC En la Figura 16, se observa mayor densidad microbiana de la Refinería Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. en la segunda repetición, 92 donde se obtuvo una concentración de bacterias de 946 x 103 UFC con mayor concentración y el de menor concentración fue en la primera repetición con 531 x 103 UFC. Figura 16. Concentraciones bacterianas en el suelo de la refinería B. Concentración de Actinomicetos en el suelo En el cuadro 29, se observa la concentración de Actinomicetos en la muestra del suelo. 531 946 698 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1ra Repeticion 2da Repeticion 3ra Repeticion N ° c o n c e n tr a c ió n d e U F C e n b a c te ri a s REPETICIONES N° microorganismos bacterianos 93 Cuadro 29. Concentración de Actinomicetos en el suelo Zona de muestreo Nº de Actinomicetos 1º muestra Refinería Maple Gas Corporation del Perú (1ra repetición) 469 x 103 UFC Refinería Maple Gas Corporation del Perú (2da repetición) 706 x 103 UFC Refinería Maple Gas Corporation del Perú (3ra repetición) 458 x 103 UFC En la Figura 17, se observa las concentraciones de actinomicetos de la Refinería Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., donde la mayor concentración es de 706 x 103 UFC en la segunda repetición y de menor concentración es la tercera repetición con 458 x 103 UFC. Figura 17. Concentraciones de Actinomicetos en el suelo de la refinería 469 706 458 0 100 200 300 400 500 600 700 800 1ra Repeticion 2da Repeticion 3ra Repeticion N ° c o n c e n tr a c ió n d e U F C e n A c ti n o m ic e to s REPETICIONES Nº de Actinomicetos 94 4.2. Identificación de los géneros de las bacterias presentes en el suelo 4.2.1. Reconociendo de las bacterias En el cuadro 30, muestra las especies identificadas en el primer y segundo muestreo en suelos contaminados con hidrocarburo. Cuadro 30. Reconocimiento de bacterias para el primer muestreo Zona de muestreo Primer Muestreo Refinería Maple Gas Corporation del Perú (1ra repetición) Enterobacter agglomeruns Enterobacter hafniae Proteus mogani Refinería Maple Gas Corporation del Perú (2da repetición) Enterobacter agglomeruns Enterobacter hafniae Serratia rubidaea Refinería Maple Gas Corporation del Perú (3ra repetición) Enterobacter cloacae Enterobacter agglomeruns Salmonella Sp. 95 4.3. Selección y elección de las bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo en el suelo 4.3.1. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la primera repetición En el cuadro 31, se observa las bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo concentraciones del 0.25 %, 0.50 %, 0.75 %, 1.00 % del petróleo refinado en la primera repetición. Cuadro 31. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo. GÉNEROS ESPECIES Enterobacter agglomeruns Enterobacter hafniae Proteus mogani A la concentración del 0.25 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. 96 A la concentración del 0.50 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. A la concentración del 0.75 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. A la concentración del 1.00 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. 4.3.2. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la segunda repetición En el cuadro 32, se observa las bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo concentraciones del 0.25 %, 0.50 %, 0.75 %, 1.00 % del petróleo refinado en la primera repetición. 97 Cuadro 32. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo. GÉNEROS ESPECIES Enterobacter agglomeruns Enterobacter hafniae Serratia rubidaea A la concentración del 0.25 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. A la concentración del 0.50 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. A la concentración del 0.75 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. 98 A la concentración del 1.00 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento bacteriano en las 4 repeticiones al 100 %, siendo eficaces las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L. 4.3.3. Bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo a diferentes concentraciones del petróleo en la tercera repetición En el cuadro 33, se observa las bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo concentraciones del 0.25 %, 0.50 %, 0.75 %, 1.00 % del petróleo refinado en la primera repetición. Cuadro 33. Bacterias identificadas con capacidad degradativa del hidrocarburo. GÉNEROS ESPECIES Enterobacter agglomeruns Enterobacter cloacae Salmonella sp. A la concentración del 0.25 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento de las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., en las 4 repeticiones. 99 A la concentración del 0.50 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento de las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., en las 4 repeticiones. A la concentración del 0.75 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento de las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., en las 4 repeticiones. A la concentración del 1.00 % del petróleo refinado con el suelo en el agar Mínimo de Sales Minerales de Davis, se obtuvo un crecimiento de las bacterias encontradas en la muestra del suelo de la refinería de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., en las 4 repeticiones. 4.4. Determinación de la eficiencia de la biorremediación de un suelo contaminado con petróleo usando el biorreactor Air Lift. 4.4.1. Determinación de la eficiencia del biorreactor Air Lift En los cuadros 34, 35 y 36, se registraron las colonias de microorganismos, el crecimiento y decrecimiento de población bacteriana y el cálculo de la eficiencia bacteriana en el proceso de la biorremediación en el cual en el cuadro 34, se observó mayor porcentaje de eficiencia microbiana es en el biorreactor cuatro (B4) de la primera repetición a una concentración de 1 mL de 100 petróleo refinado en donde creció la población microbiana y se observó menos porcentaje de eficiencia microbiana es en el biorreactor cuatro (B4) de la segunda repetición a una concentración de 1 mL de petróleo refinado en donde decreció la mayor cantidad de la población microbiana en operación de los biorreactores. Cuadro 34. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la primera repetición. 1RA REPETICIÓN Biorreactores # COLONIAS % de crecimiento y decrecimiento bacteriano % Efic. bacteriana DIA 1 DIA 8 DIA 15 Día 1 a 8 Día 1 a 15 Día 8 a 15 B0 (testigo) 2728 1630 1217 - 40.249 - 55.389 - 25.337 - 55.389 B1 (0.25 mL) 2505 1450 436 - 42.116 - 82.595 - 69.931 - 82.595 B2 (0.50 mL) 1908 1350 463 - 29.245 - 75.734 - 65.704 - 75.734 B3 (0.75 mL) 493 200 360 - 59.432 - 26.978 + 80.000 - 26.978 B4 (1.00mL) 432 731 491 + 69.213 + 13.658 - 32.832 + 13.658 101 Cuadro 35. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la segunda repetición. 2DA REPETICIÓN Biorreactores # COLONIAS % de crecimiento y decrecimiento bacteriano % Efic. Bacteriana DIA 1 DIA 8 DIA 15 Día 1 a 8 Día 1 a 15 Día 8 a 15 B0 (testigo) 758 583 284 - 23.087 - 62.533 - 51.286 - 62.533 B1 (0.25 mL) 985 757 682 - 23.147 - 30.761 - 9.908 - 30.761 B2 (0.50 mL) 1386 1066 624 - 23.088 - 54.978 - 41.463 - 54.978 B3 (0.75 mL) 926 712 414 - 23.110 - 55.292 - 41.854 - 55.292 B4 (1.00mL) 2210 1690 326 - 23.529 - 85.249 - 80.710 - 85.249 Cuadro 36. Crecimiento bacteriano en los biorreactores a través del tiempo y su porcentaje de eficiencia bacteriana en la biorremediación del petróleo refinado en la tercera repetición. 3RA REPETICIÓN Biorreactores # COLONIAS % de crecimiento y decrecimiento bacteriano % Efic. bacteriana DIA 1 DIA 8 DIA 15 Día 1 a 8 Día 1 a 15 Día 8 a 15 B0 (testigo) 802 616 408 - 23.192 - 49.127 - 33.766 - 49.127 B1 (0.25 mL) 726 557 528 - 23.278 - 27.278 - 5.206 - 27.278 B2 (0.50 mL) 875 672 700 - 23.200 - 20.000 + 4.167 - 20.000 B3 (0.75 mL) 860 660 687 - 23.256 - 20.116 + 4.091 - 20.116 B4 (1.00 mL) 975 748 946 - 23.282 - 2.974 + 26.471 - 2.974 102 4.4.2. Datos obtenidos de los biorreactores en operación y la correlación entre los parámetros medidos En los cuadros 37, 38, 39 se indican los datos registrados de Temperatura (°T), oxígeno disuelto (OD), pH y población microbiana (M.O); obtenidos de la operación de los biorreactores Air Lift con un tiempo de medición de 15 días, de las cuales se midieron en el 1er día, 8vo día y el 15vo día con 3 repeticiones en los biorreactores en operación. Cuadro 37. Datos obtenidos de la primera repetición en los biorreactores en operación 1RA REPETICIÓN BIORREACTORES DIAS OD (ppm) pH Temperatura (°C) Biomasa microbiana (UFC) B0 DIA 1 1.08 10.03 27.8 2728 B1 0.22 9.42 26.5 2505 B2 0.68 9.13 27.8 1908 B3 0.2 8.51 27.9 493 B4 0.86 9.32 28.4 432 B0 DIA 8 2.78 9.3 28.4 163 B1 0.42 8.61 27.9 145 B2 1.23 8.43 28 35 B3 0.2 8.15 27.6 20 B4 1.36 8.9 27.9 731 B0 DIA 15 3.22 7.96 26.7 1217 B1 0.3 8.11 26.6 436 B2 2.15 8.62 26 463 B3 0.23 7.66 26.9 360 B4 3.12 8.06 26.4 491 103 Cuadro 38. Datos obtenidos de la segunda repetición en los biorreactores en operación 2DA REPETICIÓN BIORREACTORES DIAS OD (ppm) pH Temperatura (°C) Biomasa microbiana (UFC) B0 DIA 1 0.46 8.14 33.7 758 B1 0.63 8.14 29.2 985 B2 0.44 8.14 27.4 1386 B3 0.54 8.06 27.7 926 B4 0.43 8.04 27.6 2210 B0 DIA 8 2.43 8.76 29.9 583 B1 3.62 9.02 30.3 757 B2 3.4 8.83 30.5 1066 B3 2.43 8.92 29.9 712 B4 2.43 8.9 30.7 1699 B0 DIA 15 3.27 9.22 30.2 284 B1 3.85 9.49 30.5 682 B2 3.3 9.34 30 624 B3 2.54 9.41 29.9 414 B4 2.95 9.57 29.8 326 104 Cuadro 39. Datos obtenidos de la tercera repetición en los biorreactores en operación 3RA REPETICIÓN BIORREACTORES DIAS OD (ppm) pH Temperatura (°C) Biomasa microbiana (UFC) B0 DIA 1 0.46 8.14 33.7 758 B1 0.63 8.14 29.2 985 B2 0.44 8.14 27.4 1386 B3 0.54 8.06 27.7 926 B4 0.43 8.04 27.6 2210 B0 DIA 8 2.43 8.76 29.9 583 B1 3.62 9.02 30.3 757 B2 3.4 8.83 30.5 1066 B3 2.43 8.92 29.9 712 B4 2.43 8.9 30.7 1699 B0 DIA 15 3.27 9.22 30.2 284 B1 3.85 9.49 30.5 682 B2 3.3 9.34 30 624 B3 2.54 9.41 29.9 414 B4 2.95 9.57 29.8 326 4.4.3. Correlación de variables En el cuadro 40, se observa las correlaciones que existen entre las variables medidas, donde la variable dependiente de Microorganismos (M.O) tiene correlación con la variable independiente del Oxígeno Disuelto (OD), la variable independiente del Oxígeno Disuelto (OD) tiene mayor correlación con la 105 variable independiente del pH, la variable independiente de pH tiene correlación con la variable independiente del Oxígeno Disuelto (OD) y la variable independiente de T (°C) tiene correlación con la variable independiente del Oxígeno Disuelto (OD). Cuadro 40. Correlaciones entre variables medidas en los biorreactores en operación OD M.O pH T (°C) Petróleo OD Correlación de Pearson 1 0,091 0,353 0,337 -0,041 Sig. (bilateral) 0,748 0,196 0,219 0,886 N 15 15 15 15 15 M.O Correlación de Pearson 0,091 1 -0,046 -0,154 -0,040 Sig. (bilateral) 0,748 0,871 0,583 0,887 N 15 15 15 15 15 pH Correlación de Pearson 0,353 -0,046 1 -0,603* -0,883** Sig. (bilateral) 0,196 ,871 0,017 0,000 N 15 15 15 15 15 T (°C) Correlación de Pearson 0,337 -0,154 -0,603* 1 0,687** Sig. (bilateral) 0,219 0,583 0,017 0,005 N 15 15 15 15 15 Petróleo Correlación de Pearson -0,041 -0,040 -,883** ,687** 1 Sig. (bilateral) 0,886 0,887 0,000 0,005 N 15 15 15 15 15 *. La correlación es significativa en el nivel 0,05 (bilateral). 106 4.5. Análisis estadístico El análisis de varianza para los promedios de microorganismos en la biotransformación del petróleo encontrado al finalizar los tratamientos (Cuadro 41), muestra que no existe diferencia estadística significativa entre los tratamientos a distintas concentraciones de petróleo a un 95 % de nivel de confianza. Cuadro 41. Análisis de Varianza FV GL Suma de Cuadrados Media Cuadrática Fcal Ftab Tratamientos 4 247160.27 61790.067 0.629 0.653 Error 10 982899.33 98289.933 Total 14 1230059.60 Se aprecia que en todos los grupos promedio de las concentraciones de petróleo y la biomasa microbiana no hay nivel de significancia con un 95 % de confiabilidad. 107 Prueba de Tukey En el cuadro 42, se aprecia la prueba de Tukey a un nivel de confianza del 95 % con la aplicación de los tratamientos en los biorreactores en operación. Cuadro 42. Prueba de Tukey (HSD) con la variable dependiente de Biomasa Microbiana y la variable independiente de Petróleo (I) PETROLEO (J) PETROLEO Diferencia de medias (I-J) Desv. Error Sig. Intervalo de confianza al 95 % Límite inferior Intervalo de confianza al 95 % Límite superior T0 T1 53,333 255,982 1,000 -789,12 895,79 T2 8,000 255,982 1,000 -834,46 850,46 T3 297,000 255,982 0,773 -545,46 1139,46 T4 -81,333 255,982 0,997 -923,79 761,12 T1 T0 -53,333 255,982 1,000 -895,79 789,12 T2 -45,333 255,982 1,000 -887,79 797,12 T3 243,667 255,982 0,870 -598,79 1086,12 T4 -134,667 255,982 0,983 -977,12 707,79 T2 T0 -8,000 255,982 1,000 -850,46 834,46 T1 45,333 255,982 1,000 -797,12 887,79 T3 289,000 255,982 0,789 -553,46 1131,46 T4 -89,333 255,982 0,996 -931,79 753,12 T3 T0 -297,000 255,982 0,773 -1139,46 545,46 T1 -243,667 255,982 0,870 -1086,12 598,79 T2 -289,000 255,982 0,789 -1131,46 553,46 T4 -378,333 255,982 0,597 -1220,79 464,12 T4 T0 81,333 255,982 0,997 -761,12 923,79 T1 134,667 255,982 0,983 -707,79 977,12 T2 89,333 255,982 0,996 -753,12 931,79 T3 378,333 255,982 0,597 -464,12 1220,79 108 Cuadro 42. Prueba de Tukey (HSD) con la variable dependiente de Biomasa Microbiana y la variable independiente de Petróleo (continuación…) HSD Tukey PETROLEO N Subconjunto para alfa = 0.05 T3 3 589,00 T1 3 832,67 T2 3 878,00 T0 3 886,00 T4 3 967,33 Sig. 0,597 Cuadro 42. Prueba de Tukey (HSD) con la variable dependiente de Biomasa Microbiana y la variable independiente de Petróleo (continuación…) COMPARACION DE MEDIAS 967 886 878 833 589 589 378 297 289 244 - 833 135 53 45 - 878 89 8 - 886 81 - 967 - Conclusión: Se puede concluir que el |Yi-Yj| < HSD; entonces se dice que esta diferencia no es estadísticamente significativa. 109 Modelo Aditivo Lineal En el cuadro 43, el análisis del Modelo Aditivo Lineal nos muestra que el error experimental e41 (UE13) es el de mayor sesgo de medición del dato obtenido con un resultado de |-1246.9| y el de menor sesgo lo tiene el error experimental e01 (UE1) con un resultado de|-347.6|. Cuadro 43. Correlación entre el Petróleo y la biomasa microbiana (M.O) Media Desv. Desviación N Petróleo 3,00 1,464 15 M.O 830,60 296,414 15 Cuadro 43. Correlación entre el Petróleo y la biomasa microbiana (M.O) (continuación…) PETROLEO M.O PETROLEO Correlación de Pearson 1 -0,040 Sig. (bilateral) 0,887 Suma de cuadrados y productos vectoriales 30,000 -243,000 Covarianza 2,143 -17,357 N 15 15 M.O Correlación de Pearson -0,040 1 Sig. (bilateral) 0,887 Suma de cuadrados y productos vectoriales -243,000 1230059,600 Covarianza -17,357 87861,400 N 15 15 110 V. DISCUSIÓN En el suelo de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., se analizó las siguientes propiedades físicas de la muestra, donde la permeabilidad del suelo es 0.89 cm/Hora, según GUERRERO (2013), pertenece a la clase de permeabilidad denominada prudentemente lenta donde está dentro del tipo de suelo; la conductividad Hidráulica del suelo es 0.51 cm/Hora, donde según SERVICE E.U.A. SOIL CONSERVATION (2008), pertenece a la clase denominada prudentemente pausada, para ello se utilizó el método de permeámetro de carga variable, donde se usan pequeños núcleos y columnas de suelo; el color del suelo analizado según MUNSELL (1975), y EDAFOLOGIA (2019), se expresó una Gradiente Munsell de 12.5, con un código de color del suelo Munsell de 2.5YR 4/8, con un color del suelo Munsell de color rojo, cuyo suelo se encuentra en el Horizonte Ag, y es normalmente encontrado a una profundidad de 0 – 5 cm y presenta moteados por la oxidación/reducción del Fe, con manchas de colores pardos/rojos con una Hidromorfia parcial (MUNSELL, 1975 y FAO, 2009); el moteado del suelo estudiado presente más del 40 % de abundancia de moteados, lo cual lo clasifica como demasiado cuantioso, tiene un contraste de los moteados catalogado como desigual con un código D, los moteados son observados con facilidad. Tanto la matriz, el valor y el croma son reconocibles a simple vista. La cual pueden diferenciarse por más de 2.5 componentes de la matriz, el valor o el croma; también tiene una categorización 111 de los tamaños de los moteados categorizado como demasiado suave por ser menor a 2 mm de tamaño con un código de MF, también tiene una categorización entre la matriz y los moteados de calmoso con código de C, con menos de 2 mm del espaciado entre el moteado y la matriz. Según la FAO (2009), la consistencia del suelo en estudio tiene una clasificación en el suelo seco de consistencia blanda con un código de BL, con una abundancia del suelo es muy débil en consistencia y rompible; se vuelve polvo o gránulos en poca presión, también tiene una firmeza del suelo fresco que es considerado como demasiado disgregable con un código de MD, con un material de suelo que se aplasta bajo presión leve, pero es coherente cuando se lo presiona todo al mismo tiempo, donde se tiene una clasificación de la adhesividad del suelo que es considerada ligeramente adherente con una codificación de SST y luego de infringir presión al suelo, tampoco se une a la mano, como también no se despega posteriormente. No se dilata perceptiblemente cuando se alejan de los dedos. También presenta una categorización de la flexibilidad de los suelos que es considerado como levemente flexible con una codificación de LFL y este suelo se perfila como una tira del suelo, luego se destroza al momento si se realiza de una forma de un aro; el suelo se desfigura con una ligera presión. El suelo de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., se analizó las siguientes propiedades químicas donde se hizo una comparación del suelo sin contaminar y el suelo contaminado, la cual el suelo sin contaminar se obtuvo los siguientes resultados obtenidos: la concentración del Calcio (Ca) es 112 Baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del Magnesio (Mg) es Moderada (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del Aluminio (Al+) es Moderada (CASTELLANOS, 2000), la concentración de la acidez (H+) es Alta (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración de la CICe es alta (SCHARGEL Y DELGADO, 1990); y para el petróleo refinado tiene una concentración que está dentro del Estándar de Calidad Ambiental para el suelo respecto al suelo Industrial que está por debajo como también apta para el uso del suelo agrícola (MINAM, 2017), la concentración del % de Saturación Cambiable es Alta (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del potasio (K) es muy baja (INIA, 2009), la concentración del fósforo (P) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del nitrógeno (N) es baja (NOM-021-RECNAT-2000), la concentración de la materia orgánica (M.O) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del pH es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); el análisis realizado al suelo contaminado con petróleo se obtuvo los siguientes resultados obtenidos: la concentración del calcio (Ca) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del magnesio (Mg) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del aluminio (Al+) es moderada (CASTELLANOS, 2000), la concentración de la acidez (H+) es moderada (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración que se ha generado de la CICe es alta (SCHARGEL Y DELGADO, 1990); y para el petróleo refinado (HTP) tiene una concentración que está dentro del Estándar de Calidad Ambiental para el suelo respecto al suelo Industrial que está por debajo pero no es apta para el uso del suelo agrícola (MINAM, 2017); la concentración del cadmio (Cd) en el suelo es baja está dentro del Estándar de Calidad Ambiental para el suelo respecto al suelo Industrial y también es apta para el uso del suelo agrícola (MINAM, 2017); la concentración 113 del plomo (Pb) en el suelo es baja está dentro del Estándar de Calidad Ambiental para el suelo respecto al suelo Industrial y también es apta para el uso del suelo agrícola (MINAM, 2017); la concentración del cobre (Cu) en el suelo contaminado es óptima (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); la concentración del boro (B) en el suelo contaminado es Alta (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); la concentración del manganeso (Mn) en el suelo contaminado es Media (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); la concentración del hierro (Fe) en el suelo contaminado es Alta (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); la concentración del pH es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del potasio (K) es Muy baja (INIA, 2009), la concentración del fósforo (P) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), la concentración del % de saturación cambiable es alta (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002); la concentración del nitrógeno (N) es baja (NOM-021-RECNAT-2000), la concentración de la materia orgánica (M.O) es baja (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002), y la concentración del zinc (Zn) en el suelo contaminado es media (MELINA Y MELÉNDEZ, 2002). El suelo de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., se analizó las siguientes propiedades biológicas donde las tres repeticiones indican que la biomasa microbiana puede ser efectivo, pero necesita profundizar las pruebas de toxicidad para verificar condiciones tóxicas (IRAM 29555-1:2003); en la segunda repetición es la mayor población de actinomicetos y en la tercera repetición es la menor población de actinomicetos encontrados; en la primera y tercera repetición son las mayores poblaciones de hongos y en la segunda repetición es la menor población de Hongos encontrados. 114 En el suelo contaminado de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., se pudo aislar e identificar las colonias bacterianas aplicando la prueba de diferenciación bioquímica, la cual se obtuvo colonias de géneros bacterianos como: Enterobacter, Serratia, Salmonella y Proteus; donde para que el sistema suelo-contaminante-microorganismos sea eficaz el recuento de heterótrofo mínimo deberá ser 103 UFC/g. Un recuento en placa inferior a 103 podría indicar la presencia de concentraciones tóxicas de materia orgánica o inorgánica. En estos casos, el suelo debe ser acondicionado para reducir las concentraciones de sustancias tóxicas y aumentar la densidad de población microbiana. Si la densidad poblacional es baja e insuficiente, la población puede incrementarse agregando microorganismos comerciales o cultivados ad hoc (BELTRÁN et al., 2018). En el suelo contaminado de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., la cual se pudo comprobar crecimiento bacteriano en el medio mínimo de sales de Davis (MMS), a ciertas concentraciones del Petróleo refinado las cuales son: 0.25 %, 0.50 %, 0.75 % y 1.00 %; en las tres repeticiones crecieron en todas las placas (16) por repeticiones, resultando como indicador de una posible biorremediación del suelo frente a un derrame de petróleo. En el suelo contaminado de la empresa Maple Gas Corporation del Perú S.R.L., se observó mayor porcentaje de eficiencia microbiana es en la primera repetición del biorreactor cuatro (B4) a una concentración de 1 mL de petróleo con un +13.658 %, y donde se menor porcentaje de eficiencia microbiana es en la segunda repetición del biorreactor cuatro (B4) a una 115 concentración de 1 mL de petróleo con un -85.249 %, esto es debido a muchos factores como: temperatura, pH, Oxígeno disuelto y Microorganimos; donde el rango óptimo de operación de los biorreactores es de 6 – 8 de pH, como efecto tiene la actividad microbiana y también la solubilidad y adsorción del contaminante, el rango óptimo de temperatura para la velocidad de degradación es óptima ya que están dentro del rango de 15 °C y 45 °C; también influye la oxidación a través de enzimas oxigenasas, a intermediarios que se incorporan al ciclo de Krebs en referencia a la disponibilidad de oxígeno; la población microbiana realiza una adaptación o aclimatación de una comunidad a un contaminante dado, determina la rapidez con la que el compuesto puede ser transformado y mineralizado (FEITKENHAUER et al., 2003; SEMPLE et al., 2001; MADIGAN et al., 2004; ALEXANDER, 1994; LAGREGA et al., 2001). El análisis estadístico de la comparación del petróleo refinado con la biomasa microbiana nos da una conclusión que no hay nivel de significancia a un 95 % de confiabilidad en el análisis de varianza, y que en la prueba de Tukey (HSD) donde no se concluye que no hay significancia, y en el análisis del Modelo Aditivo Lineal donde en el error experimentar (e11) muestra menor error en la medición del resultado, mientras que en el error experimentar (e41) muestra mayor error en la medición del resultado, esto es debido a diversos factores tales como: tiempo de medición de la temperatura, variabilidad del OD, pH y el conteo de la densidad microbiana lo que ocasiona estos sesgos estadísticos obtenidos. 116 VI. CONCLUSIONES 1. Se determinó la capacidad biodegradadora de petróleo con los microorganismos encontrados y seleccionados de una refinería. 2. Se determinó las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo contaminado con petróleo y un suelo limpio para una comparación la cual indica que no hay un impacto significativo cuando existe la presencia de un posible derrame de un petróleo. 3. Se aisló e identificó la población bacteriana heterótrofa del suelo contaminado con petróleo estudiado encontrándose diferentes géneros: Enterobacter, Serratia, Proteus y Salmonella. 4. Se seleccionó y eligió las colonias de bacterias con capacidad degradativa del hidrocarburo en el suelo contaminado con petróleo. 5. Se determinó una eficiencia de capacidad degradativa microbiana del suelo contaminado con petróleo refinado usando el biorreactor Air Lift, llegando a encontrar una mayor eficiencia microbiana en la primera repetición de las tres repeticiones realizadas en el biorreactor (B4) con una tasa de eficiencia degradativa positiva de +13.658 % en base al crecimiento bacteriano. 117 VII. RECOMENDACIONES 1. Aplicar una biorremediación ex situ para determinar la eficiencia microbiana en biorreactores para una posible biorremediación ante un posible derrame de petróleo. 2. Se recomienda realizar un modelamiento de derrame de petróleo para predecir el curso de distribución del hidrocarburo a fin de tomar la mejores las medidas de seguridad pertinente como también el impacto que ocasionaría y las medidas correctivas y preventivas para que no sea un impacto significativo. 3. Se recomienda cuantificar la concentración de hidrocarburos totales de petróleo (HTP), en usando el cromatógrafo de gases para determinar su concentración con mayor precisión y según ello determinar que colonias o biofilm bacteriano es mejor para una biorremediación frente a un posible derrame de petróleo y cumplir con las normativas legales nacionales e internacionales para que no sea un impacto significativo al ambiente y a la salud humana. 118 ABSTRACT Isolated microorganisms from the soil of a refinery were studied for their degradation capacity, in order to determine their rate of efficiency when developing in soil contaminated with refined petroleum. A sample from the soil of a refinery in the city of Pucallpa, Ucayali, Peru, was used. The microorganisms present in the soil were isolated and identified. The physical and chemical characteristics of the soil were tested in airlift bioreactors before and after contamination from the petroleum, at concentrations of 0.25 mL, 0.5 mL, 0.75 mL and 1.0 mL of refined petroleum; the microorganisms which were previously isolated and identified were inoculated. It was found that the production rate for biomass is around 13% under conditions of development where the pH is between 8.2 and 9.0, with a DO (O.D. in Spanish) of 0.77 to 3.57 mg/L and a temperature between 27.6 and 30.8 °C; the degradation efficiency rate (determined by the microbiological development) is apparently low in terms of degradation, but does allow the microorganisms to continue to be viable in the soil of the refinery. Under extreme conditions these microorganisms could be adequately processed, with technical genetic modifications, in order to increase their rate of degradation efficiency for petroleum degradation. The microorganisms that were identified belong to the Enterobacter, Proteus, Salmonella, Serratia and bacteria genre from the actinobacteria group. Keywords: Petroleum, degradation, Air litf bioreactors. 119 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA AASHTO T 248. (2014). Standard Method of Test for Reducing Samples of Aggregate to Testing Size. 7pp. ACEVEDO, E., M. CARRASCO, O. LEÓN, P. SILVA, G. CASTILLO, I. AHUMADA, G. BORIE, Y S. GONZÁLEZ. 2005. Informe de criterios de calidad de suelo agrícola. Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 205pp. AGROPECSTAR. (2001). Conceptos. [En línea]: (http://www.agropecstar.com/portal/doctos/Conceptos%20de%20producc ion.htm. 23 de Ago. 2019) AGUILAR, R. (2002). Producción de Sustratos para Viveros. Proyecto Regional de Fortalecimiento de la Vigilancia Fitosanitaria en Cultivos de Exportación no Tradicional. Costa Rica. 46pp. AGUILERA HERRERA N. (1989). Tratado de Edafología de México. Tomo 1ed. Facultad de Ciencias Universidad Autónoma de México. México. 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Diseño de análisis de varianza (ANVA) FV GL SC CM Fc Ftab Tto t-1 SCtto CMtto Ee T(r-1) SCee CMee Tt Tr-1 SCtt Prueba de Tukey Cuadro 45. Diseño de Tukey OH Tratamientos Promedio Subconjunto para alfa = 0.01 1 2 1 T0 2 T1 3 T2 4 T3 5 T4 138 Prueba de Pearson 1. Planteamiento de la hipótesis Ho: Existe correlación estadísticamente significante entre las partículas atmosféricas sedimentables y los microorganismos patógenos del aire con un nivel de confianza del 95 %. Ha: No existe correlación estadísticamente significante entre las partículas atmosféricas sedimentables y los microorganismos patógenos del aire con un nivel de confianza del 95 %. 2) Nivel de significancia α = 0,01 3) Decisión estadística Según correlación de Pearson: Sig. <= α; Aceptamos la Ho Sig. > α; Aceptamos la Ha 4) Conclusión 139 Cuadro 46. Diseño de Correlaciones de Pearson Microorganismos patógenos PAS Microorganismos patógenos Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N PAS Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N ** La correlación es significativa al nivel 0.01 (bilateral) * La correlación es significativa al nivel 0.05 (bilateral) Cuadro 47. Escala de índice de correlación de Pearson Rango Índices de R y Rho Escala 1 0.00 – 0.20 Ínfima correlación 2 0.20 – 0.40 Escasa correlación 3 0.40 – 0.60 Moderada correlación 4 0.60 – 0.80 Buena correlación 5 0.80 – 1.00 Muy buena correlación Cuadro 48. Rango de interpretaciones de los coeficientes de varianza Rango Escala CV ≤10 % Existe poca variabilidad 10 ≤ CV ≤ 33 % Existe una variabilidad aceptable 33 ≤ CV ≤ 50 % Existe una variabilidad excesiva pero tolerable CV > 50 % Existe una variabilidad excesiva 140 Modelo Aditivo Lineal Aplicando la fórmula siguiente: Yij = µ +Ti +eif, Donde: Yif = Es la respuesta obtenida en la k-ésima observación a la cual se le aplica el i-ésimo tratamiento. i = 1; 2; 3; 4; 5 tratamientos. j = 1; 2; 3 repeticiones. µ = Media poblacional Ti = Efecto del i-ésimo tratamiento eij = Error experimental. Para: i = 1, 2, 3, 4, 5 tratamientos. j = 1, 2, 3 repeticiones 141 ANEXO B. Identificación de presencia y ausencia de los microorganismos en la primera repetición Cuadro 49. Reconocimiento de la presencia o ausencia de bacterias en seis diferentes medios de cultivos de la muestra del suelo. Zona de muestreo M77 Cled McConkey Actinomicetos Manitol Salado Cetrimide Refinería Maple Gas Corporation del Perú (1ra repetición) + + - + + - Refinería Maple Gas Corporation del Perú (2da repetición) + + + + + - Refinería Maple Gas Corporation del Perú (3ra repetición) + + + + + - 142 ANEXO C. Selección de placas para la realización de pruebas bioquímicas Cuadro 50. Selección de las placas conforme al crecimiento presentado para cada muestra. Zona de muestreo Placa seleccionada 1ra muestra Refinería Maple Gas Corporation del Perú (1ra repetición) M77 Cled Refinería Maple Gas Corporation del Perú (2da repetición) M77 Cled McConkey Refinería Maple Gas Corporation del Perú (3ra repetición) M77 Cled McConkey 143 ANEXO D. Pruebas de diferenciaciones bioquímicas de las bacterias Cuadro 51. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la primera repetición MEDIOS M77 (M1) CLED (M1) CLED (M2) INDOL - - - VP - + + RM + - - SIM + + + MALONATO - - - TSI (K/A + H2S) (+) (K/A) + (K/A) + UREA + + + LIA (K/A + H2S) (+) (K/A + H2S) (+) K/K (-) CITRATO - - + Cuadro 52. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la segunda repetición MEDIOS Mac Conkey (M1) M77 (M1) CLED (M1) Mac Conkey (M2) M77 (M2) CLED (M2) INDOL - - - - - - VP + + + + + + RM - - - - - - SIM - - - + + + MALONATO - + + - + + TSI K/K (-) K/A (+) K/A (+) K/A (+) K/A (+) K/A (+) UREA - - - - - - LIA K/K (+) K/A (+) K/A + H2S (+) K/A (+) K/A (+) K/A (+) CITRATO - + + - + + 144 Cuadro 53. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la tercera repetición MEDIOS Mac Conkey (M0-1) Mac Conkey (M0-2) Mac Conkey (M1-1) Mac Conkey (M2-1) Mac Conkey (M2-2) INDOL - - - - - VP + + - + + RM - - + - - SIM - + + - - MALONATO + + + + + TSI A/A + gas (+) K/K (-) K/K + H2S (-) K/K + H2S (+) A/A + gas (+) UREA + + + + + LIA K/K (-) K/K (-) K/K (-) K/K (-) K/K (-) CITRATO + + + + + Cuadro 53. Reconocimiento de bacterias de la muestra del suelo en la tercera repetición (continuación…) MEDIOS Mac Conkey (M3-1) Mac Conkey (M3-2) Mac Conkey (M4-1) Mac Conkey (M4-2) INDOL - - - - VP + + - - RM - - + + SIM + + - - MALONATO + + + - TSI K/K + H2S (+) K/K (-) K/K + H2S (+) K/K + H2S (+) UREA + + + + LIA K/K (-) K/K (-) K/K (-) K/K (-) CITRATO + + + + 145 ANEXO E. Prueba del Modelo Aditivo Lineal Y01=u+T0+e01 Y02=u+T0+e02 Y03=u+T0+e03 Y11=u+T1+e11 Y12=u+T1+e12 Y13=u+T1+e13 Y21=u+T1+e21 Y22=u+T1+e22 Y23=u+T1+e23 Y31=u+T1+e31 Y32=u+T1+e32 Y33=u+T1+e33 Y41=u+T1+e41 Y42=u+T1+e42 Y43=u+T1+e43 e22 -683.6 e23 -901.6 e31 -1128.6 e32 -735.6 e33 -627.6 e41 -1246.9 e42 -385.9 e43 -858.9 e01 -347.6 e02 -1174.6 e03 -969.6 e11 -634.3 e12 -855.3 e13 -1002.3 e21 -906.6 146 ANEXO F. Formula del Medio Mínimo de Sales de Davis Cuadro 54. Composición para 1L de medio mínimo de sales. COMPUESTOS CANTIDAD Fosfato de potasio dibásico 5.23 g/L Fosfato de potasio monobásico 1.91 g/L Sulfato de magnesio 0.009 mL Sulfato de amonio 1 g/L Solución traza de elementos 1 mL Cuadro 55. Composición para 1L de la solución traza de elementos COMPUESTOS CANTIDAD Cloruro de cobalto 20 mg/L Ácido bórico 30 mg/L Sulfato de cobre 10 mg/L Molibdato de sodio 1 mg/L Sulfato de hierro 10 mg/L Sulfato de magnesio 2.6 mg/L Agua destilada 1000 mL 147 Figura 18. Peso de la muestra Figura 19. Preparación de la muestra 148 Figura 20. Siembra del cultivo en el agar Figura 21. Crecimiento en los medios de cultivos de la muestra de suelo 149 Figura 22. Conteo de microorganismos en el agar Plate Count Figura 23. Observación del Bacillus sp. en el microscopio 150 Figura 24. Observación del Bacilos sp. en el microscopio Figura 25. Prueba bioquímica de las bacterias encontradas 151 Figura 26. Crecimiento de las bacterias en el Agar Mínimo de Sales Minerales de Davis Figura 27. Inicio del proceso de operaciones en los biorreactores 152 Figura 28. Mediciones del pH de los biorreactores Figura 29. Mediciones del OD y °T de los biorreactores 153 Figura 30. Observación del biofilm en el biorreactor Figura 31. Observación del crecimiento de microorganismos del biorreactor 154 Figura 32. Observación del crecimiento de microorganismos de los biorreactores en los agares para su selección Figura 33. Prueba de determinación del hidrocarburo total de petróleo por el soxhlet 155 Figura 34. Prueba de análisis del boro del suelo Figura 35. Análisis para determinar la prueba de moteados y consistencia 156 Figura 36. Prueba de la permeabilidad y conductividad hidráulica del suelo Figura 37. Prueba para la determinación del color del suelo en la tabla Munsell 157 Figura 38. Extractos de muestras de los biorreactores en operación del día 15